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随着全球化石能源日渐枯竭、环境污染日益严重，用生物燃料乙醇代替不可再生的化石能源具有越来越重要的意义。随着淀粉质原料、糖质原料和木质纤维素相继成为燃料乙醇主要的生产原料，发酵用菌种仍然面临着巨大的挑战。作为产醇能力最强的细菌，运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)仍然具有蔗糖原料上副产物多、产醇率低，木质纤维素原料上可利用底物范围窄、抗逆性差等主要缺点。为鉴定乙醇发酵副产物乳酸和山梨醇、葡萄糖酸等产生相关基因，减少副产物生成，同时考察对Z.mobilis进行拓展碳源范围改造时外源基因整合的合适位点，本研究首先结合使用同源重组和基于酿酒酵母FLP-FRT系统的位点特异性重组的方法，分别构建了Z.mobilis ZM4与乳酸产生相关的基因ldhA、D-ldh以及与山梨醇、葡萄糖酸产生相关的基因gfo的缺陷型菌株ZM4(ldhA::FRT)、ZM4(D-ldh::FRT)、ZM4(gfo::FRT)；其次，通过重复使用选择标记基因cml，进一步构建得到ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)、 ZM4(ldhA::FRT)(gfo::FRT)和ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)(gfo::FRT)缺陷型菌株，从而建立了稳定的、重复性好的多重基因缺陷又无抗性选择标记的Z.mobilis菌株构建方法。最后，以ZM4为对照，对上述缺陷型菌株进行了以副产物、乙醇、生长为主要指标的评价。评价结果表明：1)ZM4(ldhA::FRT)、ZM4(D-ldh::FRT)和ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)菌株：乳酸脱氢酶酶活分别为0.609、0.566、0.594U/mg protein，均低于菌株ZM4(为0.835U/mg protein)；乳酸产量稍稍低于ZM4，而以ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)乳酸产量为最低，在基本培养基MM中所产生的乳酸远比丰富培养基RM中所产乳酸要低；相应地，ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)的乙醇生产也是最高，2%RM培养基中12h的乙醇产率达0.945g/100g(ZM4为0.900g/100g)，而单缺陷菌株ZM4(ldhA::FRT)和ZM4(D-ldh::FRT)分别为0.905、0.915g/100g；缺陷型菌株和野生型无论在RM还是MM上的生长彼此之间都没有差距。2)ZM4(gfo::FRT)菌株：缺陷型菌株和野生型分别在不同浓度的蔗糖、葡萄糖、果糖和葡萄糖/果糖混合糖为底物的培养基中生长发酵并对其进行对比分析评价。结果表明：ZM4(gfo::FRT)在所有的培养基中都没有山梨醇产生；在蔗糖和葡萄糖/果糖混合糖为底物的培养基中缺陷型菌株乙醇产率明显提高，尤其在高浓度蔗糖中产醇效果最明显，20%、36%蔗糖浓度下的最大乙醇得率分别为85.06%、83.87%，而ZM4分别为66.27%、60.56%；在葡萄糖为底物的培养基中随着浓度的升高产醇有所下降，在20%的葡萄糖中乙醇产率只达到67.59%(而ZM4为89.85%)；ZM4(gfo::FRT)在果糖中的生长发酵与ZM4没有明显差异；缺陷型菌株的生长和产醇类似，在蔗糖和葡萄糖/果糖混合糖为底物的培养基中生长较好，36%的蔗糖中最大OD600可达8左右，而野生型只有5，20%葡萄糖中生长有一定的延迟；而加入山梨醇到培养基中仅轻微改善了ZM4(gfo::FRT)在36%蔗糖中的生长和发酵，却使ZM4(gfo::FRT)在20%葡萄糖中的生长和发酵恢复到接近ZM4的水平。3)ZM4(ldhA::FRT)(gfo::FRT)和ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)(gfo::FRT)菌株：缺陷型菌株和ZM4分别在36%的蔗糖、20%的葡萄糖和20%的果糖中生长发酵，然后进行对比评价。结果表明：36%蔗糖中缺陷型菌株不产生山梨醇，副产物乳酸生成量下降，乙醇浓度明显提高，稳定期乙醇产率分别达到93.22、91.46g/L(ZM4为53.09g/L)；20%葡萄糖中缺陷型菌株虽然都有一定的生长延迟，但乳酸的产生量仍然低于ZM4，最终的乙醇产量还是稍高于ZM4，分别为77.35、88.33g/L(ZM4为74.23g/L)；缺陷型菌株在20%果糖中的生长发酵均接近ZM4，没有明显效应；缺陷型菌株在36%蔗糖中的生长虽然有24h的生长延迟，但是最后OD还是高于野生型菌株，在20%葡萄糖中双缺陷菌株延迟32h开始生长，三缺陷菌株延迟48h开始生长，但是最后三个菌株的OD相当。4)四个菌株ZM4、 ZM4(gfo::FRT)、 ZM4(ldhA::FRT)(gfo::FRT)和ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)(gfo::FRT)在发酵罐、36%蔗糖中的生长和发酵，结果表明：缺陷型菌株的生长较ZM4慢，但所达到的最大OD600值明显高于ZM4，最大乙醇浓度也均高于ZM4，分别为93.48、108.17、107.52g/L(ZM4为58.78g/L)；总体趋势与摇瓶评价的结果基本一致。