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碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)是纤维细胞生长因子家族成员之一，是一种广谱的促有丝分裂，血管形成和亲神经性细胞因子。人的碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)在多种生理及病理过程中发挥作用，包括能诱导多种细胞分化、增殖，促进血管系统形成，损伤修复以及肿瘤生长。近年来，随着对hbFGF功能研究的深入，越来越多的临床科室与美容机构开始使用hbFGF治疗相应疾病和症状，并取得显著疗效。但随之而来的问题是，hbFGF的制剂相对昂贵，不能进行普及使用。同时hbFGF生物活性强，性质不稳定。因此，迫切需要新的工业方法，为大规模、低成本制备稳定的hbFGF提供条件。
目前，重组hbFGF蛋白质的生产主要依靠大肠杆菌表达系统，但是，hbFGF的可溶性与稳定性较低，在溶液中很不稳定，静置后极易形成二聚体、三聚体甚至是多聚体，严重时出现明显的絮状沉淀，极大地影响蛋白质的活性；同时，非融合的hbFGF在原核细胞中的表达量低[1]。究其原因，一方面hbFGF的氨基酸序列中34、78、96与101位上存在4个半胱氨酸残基，容易形成分子间的二硫键而形成寡聚体(特别是二聚体)，降低hbFGF的生物学活性；另一方面，hbFGF基因中的一些密码子对于大肠杆菌来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。
为了探索高表达hbFGF蛋白质的方法，研究其结构与功能的关系，我们首先要克隆编码hbFGF的cDNA，然后利用大肠杆菌表达hbFGF蛋白质，为进一步进行蛋白质结构改造，提高其稳定性和增强其活性提供条件。
本论文的目的是：利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人小肠平滑肌肉瘤的mRNA中扩增出人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的cDNA，构建在大肠杆菌中表达hbFGF蛋白质的表达载体，优化hbFGF蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达条件，为后续的hbFGF活性研究以及蛋白质工程改造奠定基础。
本论文所获得的结果如下：1.利用RT-PCR方法对hbFGFcDNA的扩增从GeneBank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得hbFGFmRNA的核苷酸序列(468bp)。根据其核苷酸序列设计一对PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分别引入了NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点，便于将hbFGFcDNA克隆到pET29b表达载体的NdeⅠ和XhoⅠ位点。利用Trizol试剂从人小肠平滑肌肉瘤中提取总RNA，以mRNA为模板，利用RT-PCR方法，扩增具有预期分子量的RT-PCR产物。
2.pMD18-hbFGF质粒的构建及核苷酸序列测定将纯化的RT-PCR产物与pMD18-T载体进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌NovaBlue菌株的感受态细胞中。用限制性内切酶酶切方法鉴定出阳性重组质粒pMD18-hbFGF。对pMD18-hbFGF中的hbFGFcDNA进行DNA序列测定，对DNA测序结果进行BLAST分析，结果表明所克隆的hbFGFcDNA与GeneBank数据库中的hbFGFmRNA的核苷酸序列完全一致，表明利用RT-PCR技术扩增出来的hbFGFcDNA不存在任何碱基突变。
3.表达载体pET29b-hbFGF的构建用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pMD18-hbFGF阳性重组质粒，回收与纯化hbFGFcDNA后，将hbFGFcDNA连接到表达载体pET29b的NdeⅠ和XhoⅠ位点，并用连接产物转化NovaBlue感受态细胞。用菌落PCR和HincⅡ酶切方法鉴定重组表达载体pET29b-hbFGF，表达载体中的hbFGF基因产物的N端与pET29b载体上的10个连续的组氨酸标记形成融合蛋白，便于目的蛋白的检测和纯化。
4.hbFGF蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达将pET29b质粒及pET29b-hbFGF分别转化到BL21(DE3)感受态细胞中，在37℃，用1mMIPTG诱导hbFGF表达3小时。用超声方法破碎诱导的BL21(DE3)，对上清和沉淀组分别进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明hbFGF蛋白质在BL21(DE3)中得以表达。
5.hbFGF蛋白质的优化表达分别用不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间诱导hbFGF蛋白质表达。用超声方法破碎表达的BL21(DE3)，用SDS-PAGE电泳分析上清及沉淀组分中的表达产物，结果表明，不同IPTG浓度和诱导温度对hbFGF蛋白质的表达量无明显影响。
6.用Westernblot方法对hbFGF蛋白质的鉴定将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用抗多聚组氨酸的单克隆抗体及偶联碱性磷酸酶的马抗小鼠IgG二抗进行检测，结果表明，所表达的hbFGF蛋白质为hbFGF基因产物。
结论：在本研究中，我们以人小肠平滑肌肉瘤mRNA为模板，用RT-PCR方法扩增出正确的hbFGFcDNA，并以pET29b作为表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出可溶性的hbFGF蛋白质。这一研究结果为我们进一步纯化hbFGF蛋白质、研究其结构与功能的关系、进行蛋白质结构改造，提高其稳定性和增强其活性提供条件。