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作为世界主要粮食作物之一,水稻对解决人类粮食安全问题有重要意义。白叶枯病是仅次于稻瘟病的水稻第2大病害,会造成水稻大量减产甚至绝收。化学防治虽然一定程度上能减轻病害,但其成本相对较高,容易引起病原物抗药性,并且对环境造成长期污染。与之相比,培育抗性品种无疑是一种更为经济、有效和安全的方式。
疣粒野生稻中存在众多未知抗病基因,它在整个生育期对白叶枯病都表现高抗,甚至免疫。本研究利用抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs)法,根据NBS类R基因的保守区核苷酸序列设计简并引物,从白叶枯病感病轮回亲本栽培稻8411及其与疣粒野生稻进行体细胞杂交后得到的稳定高抗白叶枯病新种质SH5、SH76基因组中克隆到3个520 bp左右的NBS抗病基因同源序列,以此为探针从水稻基因组中筛选到2个推测的NBS-LRR抗病同源基因,暂命名为NL-SH76、NL-8411α;通过生物信息学分析及RT-PCR技术对其抗病性进行了研究,结论如下:
1.克隆获得的NL-SH76基因组序列与预测基因有99%的同源性,位于水稻11号染色体BAC克隆B1112E06上,使用10余对引物对NL-SH76 cDNA预测编码区进行扩增,多次测序均未发现预期目的片段,其是否为编码区序列,尚需进一步实验。
2.克隆获得的NL-8411α基因组序列与预测基因有96.1%的同源性,位于水稻11号染色体BAC克隆OSJNBa0004D06及OSJNBa0023F01重叠区上;采用RT-PCR技术从水稻SH5和SH76 cDNA中扩增出NL-8411α基因的完整编码区,该编码区序列长度为3105 bp,编码1034个氨基酸,氨基酸序列分析显示其具备CC-NBS-LRR类植物抗病基因的结构特征。
3.半定量RT-PCR分析表明,在取样时间范围内,NL-8411α的表达在抗、感品种中存在显著差异,且受到水稻白叶枯病菌Zhe173的诱导。
4.Blastn和blastp比对未发现与NL-8411α同源性较高且功能已知的基因,其NBS保守区序列与番茄Prf基因最为接近,Prf基因对与水稻白叶枯菌来源相似的假单胞菌属丁香假单胞杆菌番茄致病菌变种有相关抗性。并发现NL-8411α在水稻品种日本晴中的等位基因为单拷贝。
5.对NL-8411α基因电子定位发现其处于水稻11号染色体物理图谱的长臂末端,但与11号染色体上已定位或克隆的8个白叶枯病抗病基因均具有不同序列或处于不同的染色体位置。
本研究以水稻白叶枯病抗性种质为材料,以非抗性亲本为对照,增强了所克隆RGAs的抗病针对性,结合生物信息学分析和RT-PCR技术克隆到一个与水稻白叶枯病抗性相关的候选基因NL-8411α,为后续研究奠定基础。