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禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是一种能引起家禽局部或全身性传染病的细菌,能与很多病毒性疾病和其他细菌性疾病并发。随着世界集约化养鸡行业的发展,大肠杆菌病的发病率和死亡率也逐步升高,给养禽业的发展造成了巨大的损失。在大肠杆菌研究中,人们提出了一种新的基因调节子,即为非编码小RNA(small non-coding regulatory RNA,sRNA),其在转录后可调节基因的表达水平,主要参与的调节途径包括转录翻译调控、铁代谢途径、糖代谢途径、膜蛋白生物合成、群体感应系统以及致病菌的致病力调节等。而RyhB也是小RNA的一种,在细菌致病调控网络中起到关键作用。此外,RyhB除了参与调节铁代谢外,在霍乱弧菌和痢疾志贺氏菌中,还发现RyhB的还能调控细菌动力、化学趋化、生物膜、酸性耐受力、氧化还原甚至毒力基因的表达等。因此,研究RyhB与APEC致病性之间的联系,为防控大肠杆菌病提出实验依据。本研究以实验室RyhB缺失株为基础,研究RyhB缺失条件下对细菌的生物学特性的影响,并利用蛋白质组学技术比较野生株与缺失株差异表达的蛋白,筛选出影响APEC毒力等相关特性的相关靶基因,进一步揭示了RyhB与APEC致病力之间的关系。具体研究内容和结果如下:1、sRNA-RyhB对禽致病性大肠杆菌生物学特性影响本实验分别从生长曲线实验、组织载菌量实验、菌体超显微结构观察实验、生物被膜形成能力检测实验、LPS完整性实验、环境耐受力检测实验等来研究禽致病性大肠杆菌RyhB对细菌的生物学特性影响。生长曲线实验结果表明,RyhB没有影响其生长性能;组织载菌量实验表明,注入△RyhB肝脏组织载菌量相比野生株的肝脏组织载菌量降低了6.91倍;超显微结构观察实验表明,同样的生长条件下,亲本菌AE17有完整的菌毛,而缺失株则没有完整菌毛;生物膜试验结果表明,RyhB基因缺失后,生物膜的形成能力减弱,回复株有所回复,但并没有回到野生株生物膜形成能力;LPS完整性实验结果表明RyhB缺失没有影响有LPS的完整性;环境耐受力实验表明,缺失株△RyhB对氧化不敏感,热应激增强,耐酸性增强,耐碱性减弱。2、sRNA-RyhB调控禽致病性大肠杆菌靶蛋白的筛选为探索RyhB可能调控的毒力基因。应用蛋白质组学技术,从蛋白水平比较野生株和缺失株之间差异蛋白表达情况。结果显示,与野生株相比,共发现62个差异蛋白。其中Omsc、Galu、Nlpe、Tata、GmhA、proX、inFA、cysE可能是RyhB直接调控的毒力相关基因。通过GO(Gene Ontology)分类结果显示,差异表达蛋白参与的细胞组分包括细胞膜、胞外区、细胞器、核质组成等;分子功能主要表现抗氧化功能、蛋白结合、催化活性、分子功能调节、信号传导、转运蛋白功能等;参与的生物学过程主要包括调控生物调节、运动过程、新陈代谢过程、多细胞生物学过程、应激反应、单一生物体调节过程等。通过实时荧光定量PCR技术检测其中10个差异蛋白基因的转录水平,结果与蛋白质组学一致。3、sRNA-RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力以及影响生物膜形成靶蛋白分析本实验基于蛋白质组学技术,筛选得到与酸性耐受力有关的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术对筛选的差异蛋白基因的转录水平进行检测,其结果与蛋白质组学结果一致。在筛选出的差异蛋白的基础上,结合在线预测软件筛选可能直接作用的与生物膜形成有关的靶蛋白。实验成功构建了pET28a-cysE表达载体,获得可溶性cysE蛋白,用Western Blot检测重组质粒表达产物,在蛋白大小约36kDa处有一条蛋白带,表明表达产物有良好的特异性。以上研究结果表明,RyhB的缺失能影响禽致病性大肠杆菌菌毛的表达并降低肝脏的载菌量、降低生物膜的形成、增强热应激、增强耐酸性、减弱耐碱性。表明RyhB在调控APEC毒力作用中扮演重要角色,并结合蛋白质组学技术筛选出与生物膜形成、酸性耐受力有关的蛋白。为后续研究RyhB调控靶点奠定了一些基础,同时也为进一步研究APEC的致病作用及宿主抗病机制提供一些实验依据。