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将聚乙二醇分子与生物活性分子尤其是蛋白质和多肽类药物共价结合已经成为现今非常流行的改善和控制药物的生物分布、药代动力学和分子毒性的有效手段。PEG耦联后,能够遮蔽掉多肽或蛋白质分子的抗原决定簇,从而降低网状内皮组织的清除或免疫系统的识别,同时也能抵御酶解。PEG修饰后还可以增加多肽或蛋白质分子的表观分子量,从而降低肾清除率,改变其在生物体内的分布。在第一代PEG化化学的基础上,PEG化已经很好地实现了定点特异性修饰的目标,本论文即采用能够特异性地和蛋白质或多肽的N端α氨基共价结合的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-PAL)对几种蛋白质类药物进行化学修饰。从这些研究中掌握了一些蛋白质类药物聚乙二醇化的基本技术手段和反应规律,建立起一套比较成熟的蛋白质类药物化学修饰的开发流程,也获得了这些药物的具体二代产品,为它们的进一步开发和应用提供支撑。
1.重组人内皮抑素的N端氨基定点PEG化修饰
内皮抑素能够特异性地抑制上皮细胞的增殖,显著抑制血管生成和肿瘤生长。本课题中采用平均分子量为5000道尔顿的mPEG-PAL对重组人内皮抑素的N端氨基进行了定点化学修饰,获得了单PEG化修饰产品mPEG-rhES。这一位点特异性的化学反应条件通过L9(34)正交试验获得。在这个研究中,我们研究了mPEG-rhES的稳定性和抗肿瘤活性。SDS-PAGE,RP-HPLC和紫外分光光度分析被用来检测产品的纯度和稳定性。当使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶进行酶解,或者将产品放置到比较极端的环境时,mPEG-rhES表现出比rhES要高得多的稳定性。用抑制小鼠H22肝癌生长的效率来检测修饰的和未修饰的rhES的体内生物活性。在多次单剂量实验后发现,连续7天,每天注射0.25,0.50和1.00μmol/kg的未修饰rhES的小鼠体内的肿瘤抑制率分别为26.9％,43.0％和64.9％;而与之对应的,单剂量为未修饰rhES一半的mPEG-rhES,即每天注射剂量为0.13,0.25和0.50μmol/kg时,肿瘤抑制率与rhES基本接近,分别为24.8％,38.0％和64.5％。活性实验中的所有实验组与阴性对照组相比均统计为显著。由此,PEG化不仅增强了rhES的稳定性,而且在一定程度上提升了其抗肿瘤活性。
2.重组人粒细胞集落刺激因子的N端氨基定点PEG化修饰
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是现今临床上抗肿瘤化疗、放疗手术之后最重要的辅助药物之一,它的主要功能在于刺激嗜中性粒细胞增殖以缓解由于化疗、放疗造成的免疫系统伤害。此外,G-CSF在自体干细胞移植中也用于动员外周造血干细胞。尽管G-CSF具有重大的治疗价值,然而在实际应用却受到体内半衰期过短因而需要频繁重复注射的限制。为了解决这一问题,我们利用两种不同分子量(5 kD和20 kD)的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-PAL)对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端氨基进行了定点PEG化修饰。通过正交实验得到最佳修饰条件,此时rhG-CSF的单修饰产率达到72.89％。我们发现,PEG化的rhG-CSF比原先的rhG-CSF具有更高的体外稳定性,修饰后rhG-CSF的体内活性也得到了很大的提高,体内作用时间得到很大延长。因此,对于rhG-CSF的N端氨基定点PEG化修饰可以显著提到rhG-CSF的临床应用价值。