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研究背景和目的胆管癌是起源于胆道上皮系统的恶性肿瘤。虽然胆管癌的整体发病率较低,但我国和东南亚国家是胆管癌的高发地区,且发病率呈现逐年上升趋势。胆管癌具有恶性程度高、临床预后差的特点,多数患者确诊时已经发生转移,且术后极易复发。因此,关于胆管癌的病因和复发转移的机制研究,对胆管癌的诊疗具有非常重要的意义。PTEN(Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10)是1997年发现的一种抑癌基因,其中文名为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因。随着研究的深入,人们发现PTEN在前列腺癌、膀胱癌和肺癌等多种肿瘤中存在突变、缺失或表达减少的情况。PTEN表达的改变可以通过负向调控PI3K-AKT-m TOR信号通路,从而在肿瘤的发生进展过程中起到重要作用。本研究对PTEN在胆管癌中的作用进行初步探索时已经发现,胆管癌中存在较高比例的PTEN突变或缺失情况,且PTEN表达与胆管癌的复发转移密切相关。外泌体是由多种细胞产生的直径在30到150纳米的细胞外囊泡,可通过输送蛋白质、脂质、多糖和核酸分子等物质介导细胞间的通讯。据报道,肿瘤细胞来源的外泌体在胶质母细胞瘤、乳腺癌、白血病、鼻咽癌和胰腺癌等多种肿瘤的进展过程中起到重要作用。外泌体能够通过上调多种血管生成相关基因表达,促进肿瘤微环境中血管内皮细胞的增殖、转移和出芽。高侵袭性肿瘤细胞来源的外泌体可以介导靶细胞的上皮间质转化过程。此外,外泌体还能通过长距离的信号转导,介导转移前生态位的形成,进而促进播散肿瘤细胞的定植和存活。目前,关于肿瘤细胞来源的外泌体在胆管癌进展和转移中的作用及机制尚不清楚,重要肿瘤驱动基因对该生物学过程的精细调控也少见报道。而我们发现,抑癌基因PTEN缺失的促肿瘤转移功能与肿瘤细胞来源外泌体的生物学特性高度重合,这促使我们思考两者之间的可能关联。明确PTEN表达与胆管癌细胞外泌体分泌的关系,以及它们在胆管癌转移中的作用,将具有十分重要的科学价值。外泌体的生成源于细胞内吞途径,细胞的溶酶体功能与外泌体的分泌密切相关。已有文献报道,AKT和m TOR分子可以通过调节Mi T-TFE基因影响溶酶体的新生和功能。PTEN作为PI3K-AKT-m TORC1上游的信号分子,是否也能对溶酶体的功能产生重要调节作用,以及该作用是否能够影响外泌体的分泌,目前尚无相关研究。明确这一问题,将帮助我们更好地解释PTEN影响胆管癌复发转移的原因和机制。本课题将基于PTEN在胆管癌中的表达情况,建立PTEN差异表达的胆管癌细胞,深入探究PTEN对胆管癌细胞的溶酶体功能和外泌体分泌的影响,并通过体外细胞和动物体内实验,进一步明确其在胆管癌转移过程中的作用及具体机制,为胆管癌的诊疗提供新的思路。研究方法1、回顾性分析胆管癌临床样本中PTEN表达水平对胆管癌临床预后和复发转移的影响。2、应用慢病毒、腺病毒感染或质粒、干扰RNA转染的方法建立PTEN差异表达的胆管癌细胞,包括PTEN过表达、PTEN干扰、PTEN敲除及对照细胞。3、Transwell细胞迁移实验、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验和成球实验测定PTEN差异表达对胆管癌细胞生物学行为的影响。4、建立经尾静脉肺转移和经脾肝转移小鼠模型,体内验证PTEN差异表达对胆管癌转移的影响。5、超速离心法提取PTEN差异表达胆管癌细胞的外泌体,通过电镜、NTA检测、Western-blot实验检测PTEN差异表达对外泌体分泌的影响。6、检测PTEN差异表达胆管癌细胞分泌的外泌体对胆管癌细胞迁移、平板克隆形成的影响。7、回顾性分析胆管癌临床样本中外泌体特异性标志蛋白CD63与PTEN表达的相关性,以及CD63表达与胆管癌复发转移的关联。8、免疫荧光技术检测PTEN差异表达细胞中CD63和HGS的表达,明确PTEN对细胞中MVB数量的影响。9、电子显微镜观察PTEN敲除和对照胆管癌细胞中多囊泡体(Multivesicular Body,MVB)和管腔内小泡(Intraluminal vesicle,ILV)的结构和数量。10、Lysosensor和Lysotracker染色检测PTEN差异表达胆管癌细胞中溶酶体的数量和功能。11、Western-blot和RT-PCR实验检测PTEN差异表达细胞中组织蛋白酶成分的表达变化。12、探针法检测PTEN差异表达胆管癌细胞中溶酶体的p H值。13、RT-PCR检测PTEN差异表达胆管癌细胞中V-ATPase各组分表达的变化。14、免疫荧光技术检测PTEN差异表达胆管癌细胞中转录因子EB(Transcription factor EB,TFEB)的亚细胞定位情况。研究结果1、PTEN在胆管癌中存在一定比例的突变缺失,PTEN缺失的胆管癌患者临床预后较差;PTEN缺失与胆管癌的复发转移密切相关。2、降低PTEN表达促进胆管癌细胞的迁移、侵袭、克隆形成和自我更新。3、PTEN敲除促进胆管癌细胞的体内转移。4、降低PTEN表达促进胆管癌细胞的外泌体分泌,增加胆管癌细胞中MVB的数量。5、PTEN低表达胆管癌细胞来源的外泌体更能促进胆管癌细胞的生长、迁移。6、抑制溶酶体的功能可以增加细胞中MVB的数量,促进外泌体的释放。7、PTEN通过自身蛋白磷酸酶活性对TFEB进行去磷酸化,从而介导TFEB的核转位,促进溶酶体的新生和功能。8、PTEN通过介导V-ATPase组分ATP6V1A的表达上调,促进溶酶体的酸化。9、PTEN缺失可以通过抑制溶酶体功能,阻碍MVB在溶酶体中的降解代谢,促使其与质膜融合增加外泌体的释放,进而促进肿瘤细胞的转移。结论本研究发现在收集到的108例胆管癌样本中,有将近一半存在PTEN的突变或缺失,表现为PTEN的低水平表达;PTEN低表达与胆管癌的恶性进展和复发转移密切相关,并且能够预示胆管癌患者的不良预后;PTEN的表达降低不仅可以通过抑制TFEB的核转位,影响溶酶体的新生,还能通过下调V-ATPase组分,特别是ATP6V1A的表达,损害溶酶体的酸化功能;溶酶体的数目减少和功能受损能够通过抑制MVB在溶酶体中的降解代谢,促使其与质膜融合发生外排,增加外泌体的分泌,从而促进胆管癌细胞的存活、迁移和转移过程。总之,本研究通过深入探讨PTEN表达、溶酶体功能和外泌体分泌三者之间的关联,首次系统性地阐述了PTEN调节胆管癌转移的确切机制,为胆管癌的诊疗提供了新的理论依据。