论文部分内容阅读
目的:CD4+ CD25+调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）是机体重要的免疫调节功能细胞，能下调免疫反应维持机体免疫耐受，它在肿瘤免疫、移植免疫和自身免疫病中均发挥重要作用。但Treg 细胞在胃癌不同类型组织的表达情况及增高机制尚未阐明。通过本研究拟探讨：建立体内调节性T 细胞准确的检测方法；研究调节性T 细胞在不同分期胃癌患者外周血、腹水、肿瘤组织、癌旁淋巴结等不同部位的分布特点及意义；初步探索调节性T 细胞在胃癌中特异性增高的机制。从而进一步揭示免疫逃逸机制及发掘Treg 细胞潜在的临床应用价值。
方法:利用Foxp3 特异的单克隆抗体和Treg 细胞膜表面特性，分别建立Foxp3-FITC 、CD25-PE 、CD4-PerCP 、CD3-APC 及CD25-FITC 、CD127-PE 、CD4-PerCP、CD3-PC7 两种4 色流式细胞术检测Treg 细胞的方法，比较二者同一性。应用流式细胞术分选Treg 细胞，RT-PCR 检测Foxp3 mRNA 的表达，探讨Foxp3mRNA 和蛋白水平的一致性。应用Foxp3 胞浆染色和CD25，CD127 膜表面染色流式细胞术，检测60 例不同分期胃癌患者外周血、腹水、肿瘤组织、癌旁淋巴结、正常组织中Treg 的表达情况，Real Time RT-PCR 技术检测外周血Foxp3 mRNA 水平表达情况。收集39 例不同分期胃癌患者血清和腹水上清液，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测TGF-β1、PGE2、IFN-γ、IL-4 等细胞因子的表达水平，研究胃癌免疫状态及抑制因子在Treg 细胞增高的作用。
结果:1． Treg 细胞不同水平检测方法学的确立：建立鉴定Foxp3 mRNA 的反转录PCR 体系；建立应用Foxp3-FITC/CD25-PE/CD4-PerCP/CD3-APC 及CD25-FITC/CD127-PE/CD4-PerCP/CD3-PC7 两种4 色流式细胞术检测Treg 细胞的方法；应用Fxop3 胞浆染色与CD25high CD127low 膜表面染色鉴定Treg 细胞具有一致性（相关系数r＝0.983，P<0.01）；Treg 细胞特异性基因Foxp3 的mRNA 和蛋白水平均有表达。2．不同分期胃癌患者外周血、腹水、肿瘤组织、癌旁淋巴结等组织中调节性T 细胞的表达：应用相对定量Real Time PCR 方法对外周血Foxp3 mRNA 进行检测，发现在肿瘤患者外周血中Foxp3 的表达高于正常对照（P<0.05），Foxp3mRNA 表达量随着肿瘤进展而升高，TNMⅠ病人外周血Foxp3 mRNA 即有显著增高；流式细胞术检测各期胃癌外周血Treg 细胞占CD4+ T 细胞的比例显著高于正常对照（P<0.05），正常组织未见淋巴细胞浸润。腹水、肿瘤、淋巴结中都存在较高水平的Treg 细胞；在外周血和腹水组织中，CD25+与Foxp3+的相关系数为-0.052，二者无相关性；而CD25high 与Foxp3+的相关系数达到0.731，P<0.01，二者显著相关，在肿瘤组织和癌旁淋巴结中，CD25+与Foxp3 的相关系数为0.807，P<0.01，二者显著相关；CD25high 与Foxp3 的相关系数为0.608，P<0.01，二者显著相关；各组织类型的调节性T 细胞占CD4+T 细胞的比例呈现出下列模式：肿瘤组织>癌旁淋巴结>腹水组织>外周血>健康对照外周血；胃癌早期患者外周血中调节性T 细胞的数目相比正常对照未现差异，晚期相比早期显著增加（P<0.05）；在腹水和肿瘤组织中，Treg 细胞在晚期患者相比早期有显著升高（P<0.05）；在癌旁淋巴结中，调节性T 细胞的数目在TNM 各期均未见显著差异。3．不同分期胃癌患者血清和腹水上清中细胞因子的表达：IFN-γ在患者腹水上清的表达与正常对照相比，显著升高（P<0.05），晚期患者相比早期患者，IFN-γ表达水平显著下降，（P<0.05）；各期胃癌患者血清和腹水中IL-4 的表达相比对照显著上升（P<0.05），晚期与早期相比，腹水上清中IL-4 表达水平显著下降，（P<0.05）； IFN-γ/ IL-4 在患者体内相比健康对照显著下降（P<0.05），晚期相比早期无显著差异；TGF-β1 在各期胃癌血清和腹水上清相比正常对照显著下降（P<0.05），晚期相比早期，血清TGF-β1 显著上升（P<0.05），晚期患者TGF-β1 水平与Treg 细胞显著相关（ P<0.05 ）；各期胃癌患者腹水PGE2 的表达水平相比正常对照显著上升（ P<0.05 ），晚期患者与早期相比，腹水上清中PGE2 表达水平显著上升（P<0.05），各期患者PGE2 水平与Treg 细胞水平显著相关（P<0.05）。
结论:（1）CD4+CD25+Foxp3+T 细胞是体内独特的调节性T 细胞（Treg）亚群，CD4+CD25high CD127low 表面标记与CD4+CD25+Foxp3+相一致，可作为有效膜标志鉴定、筛选Treg 细胞。（2）胃癌患者相比健康人体内存在高水平的Treg 细胞，Treg 细胞在肿瘤局部分布数量大于外周组织，具体数量在各组织类型呈现出固有模式：肿瘤组织>癌旁淋巴结>腹水组织>外周血。（3）不同分期胃癌患者外周血、腹水、肿瘤组织、癌旁淋巴结中Treg 细胞相对含量随肿瘤进展逐渐升高，Treg 细胞相对含量与胃癌分期关联密切，有助于我们进行胃癌进展判断。（4）肿瘤局部与外周组织中的Treg 细胞表面标志存在差异，肿瘤局部组织为CD4+ CD25high T 细胞，在外周则表现为CD4+ CD25+ T 细胞。（5）胃癌患者免疫状态发生混乱，Th1/Th2 细胞发生向Th2 细胞漂移，但该变化可能主要影响胃癌发生，与胃癌进展关联较小。晚期胃癌TGF-β1 水平与Treg 显著相关，可能参与晚期Treg 诱导增殖，早期和晚期胃癌患者PGE2 水平均与Treg 显著相关，PGE2 与COX-2、Foxp3等上下游分子组成的信号通路可能全过程参与胃癌患者体内Treg特异增高。