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背景与目的：
在世界范围内癌症死因排序中，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)居第3位，而90％的结直肠癌病人死于肿瘤转移。目前认为结直肠癌转移是癌细胞通过遗传及表观遗传途径获得一系列特殊生物学功能的多因素、多步骤的过程。与肿瘤转移有关的基因相继被发现，以乳腺癌为例，检测转移基因的诊断试验已经初步显示出这些基因在预后评估及治疗选择中的作用。然而，转移基因的诊断试验在结直肠癌的预后评估中仍未被广泛应用，TNM分期仍然是目前评估病人预后的主要手段。
淋巴结转移是区分I/II期与III期结直肠癌的一个重要标志，也是治疗方案选择的一个重要指标。然而，是否存在淋巴结转移通常需手术后才能确定，且往往受到手术摘除的淋巴结数目的影响。这意味着使用这种分期方法十分容易低估(understage)病人的肿瘤分期，进而影响下一步治疗方案的选择及病人的预后。因此，建立分子学分期系统(molecular staging)有助于更准确的进行预后评估及治疗选择，并且已逐渐成为肿瘤防治的一个主流方向。本研究通过比较淋巴结转移阴性及淋巴结转移阳性的结直肠癌原发灶中肿瘤细胞的蛋白表达差异，并通过质谱分析获得蛋白质序列，以期发现与淋巴结转移有关的蛋白标志物，为预防及控制结直肠癌转移提供分子基础。
此外，在肿瘤转移的过程中，肿瘤细胞必需首先侵袭突破细胞外基质，进入血液或淋巴循环，并以低密度的肿瘤细胞数量在肿瘤微环境外生存，产生抵抗Anoikis凋亡(细胞脱离细胞基质而进入程序性死亡)的能力，最终到达靶器官，并定植增生形成转移灶。目前认为上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤细胞获得转移播散能力的重要途径。本研究在通过蛋白质组学分析淋巴结转移阴性和阳性的结直肠癌标本的基础上，对新发现的转移标志物，肌动蛋白结合蛋白Transgelin进行了进一步的生物学功能分析，以了解Transgelin在结直肠癌淋巴结转移中所起的作用，以及Transgelin与EMT的关系，为进一步治疗干预提供新的靶点。本研究分两部分：
第1部分：结直肠癌淋巴结转移的差异蛋白质组学分析
第2部分：Transgelin调节结肠癌细胞的侵袭和转移
方法：
第1部分：本研究采用激光显微切割(laser capture microdissection，LCM)从冰冻切片上获得结直肠癌肿瘤细胞，进行蛋白提取及荧光定量标记，进而通过双向差异凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE)，比较12例淋巴结阴性及12例淋巴结阳性的结直肠癌原发灶中肿瘤细胞的蛋白表达差异，并通过质谱分析获得蛋白质序列。在结直肠癌组织芯片上进行Transgelin免疫组织化学染色，明确Transgelin在淋巴结阴性和阳性的结直肠癌原发灶中的表达水平。
第2部分：利用RNAi技术，通过microRNA靶向下调(knockdown) Transgelin表达，建立HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD结肠癌稳定细胞系及相应的对照细胞系，分析细胞的体外侵袭能力、细胞集落形成能力、抵抗Anoikis凋亡的能力，以及Transgelin与EMT的关系。
结果：
1.通过LCM/2D-DIGE获得的结直肠癌细胞和正常粘膜细胞的蛋白点表达丰度的中位技术变异常数分别为9.37％和10.09％，根据这一数值计算，要检出不同组之间蛋白表达差异达到2倍以上的蛋白点，并维持Ⅰ类错误概率少于0.05及检验效能达到80％，每实验组至少需要10例样本。
2.每张2D胶上平均获得2100个蛋白点，其中980个蛋白点的胶与胶之间匹配率达到90％以上，16个蛋白点在淋巴结阴性和阳性的结直肠癌细胞中存在差异表达并可能作为潜在的转移标志物。质谱分析鉴定出6个蛋白点，其中3个为肌动蛋白结合蛋白Transgelin的不同亚型，Transgelin作为单一标志物预测淋巴结转移的曲线下面积(AUC)达86.8％(P=0.002)。
3.免疫组织化学染色在结直肠癌组织芯片(共94例)中证实，Transgelin在淋巴结转移阳性的结直肠癌原发灶中的阳性表达较淋巴结转移阴性者更常见(P=0.036)。
4.根据8号染色体短臂杂合子缺失(LOH)和杂合子保留(ROH)将结直肠癌标本分为两组，通过LCM/2D-DIGE发现89个蛋白点在两组之间呈差异表达。质谱分析鉴定出26个蛋白点，其中14个蛋白点在8p LOH标本中高表达，12个蛋白点呈低表达。在14个高表达的蛋白点中，有2个点被鉴定为Transgelin。
5.在结直肠癌标本及相应的正常粘膜之间的差异蛋白质组分析中，发现424个蛋白点呈差异表达，质谱分析鉴定出56个蛋白点，其中24个蛋白点在结直肠癌标本中高表达，32个蛋白点低表达。
6.利用miRNA技术靶向下调Transgelin表达，建立HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD结肠癌稳定细胞系，其Transgelin mRNA及蛋白质水平较相应的对照稳定细胞系下降80～90％。
7.下调Transgelin使HCT116细胞的侵袭能力下降>50％(P<0.01)，SW480细胞的侵袭能力下降27％(P<0.01)。转染TAGLN突变体质粒使Transgelin重新恢复表达后，HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD细胞的体外侵袭能力分别上升57％和50％(P<0.01)。
8.HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD细胞分别较相应的对照细胞HCT116CTRL和SW480CTRL的集落形成数目减少55％和40％(P<0.01)。
9.诱导Anoikis凋亡后，HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD细胞发生凋亡的比例分别为相应的对照细胞系的1.4倍和1.8倍(P<0.01)，将细胞重新接种到常规培养皿中继续培养24 h后发现，HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD细胞的存活数量仅为相应对照细胞系的60～70％(P<0.01)。
10.在HCT116细胞中，下调Transgelin能促进上皮标志物occludin的表达，降低间质标志物vimentin和fibronectinl的表达；在SW480细胞中，下调Transgelin仅降低fibronectinl的表达。
结论：
1.利用LCM/2D-DIGE定量蛋白质组学技术结合质谱分析能发现淋巴结转移阴性与淋巴结转移阳性的结直肠癌之间细微的蛋白质表达差异。
2.参与肿瘤发生和肿瘤转移的蛋白绝大部分是不相同的。
3.肌动蛋白结合蛋白Transgelin在淋巴结转移阳性的结直肠癌中较淋巴结转移阴性者明显上调，在染色体8p LOH的结直肠癌中与8p ROH相比亦呈上调趋势，但在全部结直肠癌标本与正常粘膜的比较中，则无明显表达差异。
4.下调Transgelin降低HCT116和SW480结肠癌细胞的侵袭转移。
5.下调Transgelin减少HCT116和SW480结肠癌细胞的集落形成。
6.下调Transgelin增加HCT116和SW480结肠癌细胞的anoikis凋亡。
7.Transgelin调节HCT116和SW480结肠癌细胞部分EMT标志物的表达。