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芥蓝(Brassica oleracea L.var.alboglabra)属十字花科芸薹属一二年生草本植物,为我国华南地区特产蔬菜。近年来已被很多地区引种栽培。营养丰富,风味独特。目前生产上主要应用的是常规品种,杂交一代品种很少,迫切需要培育芥蓝雄性不育系,用于杂种种子生产。
近年的研究表明茉莉酸类物质与植物的花粉发育有关,在拟南芥上的研究发现茉莉酸不能正常合成的植株即合成过程中缺失某一种关键酶的突变体均表现为雄性不育。拟南芥DAD1基因编码一个磷脂酶A1,它催化磷脂转化为亚麻酸,这是茉莉酸生物合成的起始步骤。如该基因失活,则导致花药不能正常开裂,花粉粒失去活性,同时花蕾开放也被延迟。
本研究根据已知DAD1基因序列的保守区设计引物,克隆芥蓝DAD1基因相应的保守区域,构建沉默表达载体,包括反义载体与干涉载体,再分别转化芥蓝,获得转基因植株,为创制芥蓝雄性不育材料用于杂交育种奠定基础。主要取得以下结果:
1 芥蓝花药不开裂基因DAD1片段的克隆
以芥蓝基因组DNA为模板,用设计的特异引物进行PCR扩增,得到700bp左右的扩增产物,将其连接到T载体上,进行序列测定。结果表明,该基因片段长678bp,无内含子。与拟南芥DAD1基因核苷酸序列的一致性达到88％,与同为十字花科芸薹属的普通白菜、菜心、青花菜、花椰菜的DAD1核苷酸序列的一致性高达97％～98％。由核苷酸序列推导的氨基酸序列与拟南芥DAD1氨基酸序列的一致性为91％,包含脂肪酶的特征序列GHSLG与活性中心三联体的氨基酸残基。表明克隆的片段为芥蓝DAD1基因的部分序列。
2 芥蓝DAD1基因沉默载体的构建
根据已获知的芥蓝DAD1基因片段序列,设计带有酶切序列的引物,将酶切的扩增片段反向连接到pBI121中CaMV35S启动子下游SmaⅠ与Xba Ⅰ位点之间,经PCR扩增与双酶切鉴定表明片段已经连入,成功构建了反义表达载体。先将片段反向连入pFGC5941的Sma Ⅰ与Xba Ⅰ位点之间,再将片段正向连入已含反义片段的pFGC5941的Nco Ⅰ与Swa Ⅰ位点之间,PCR扩增与双酶切鉴定表明成功构建了DAD1基因干涉载体。分别导入农杆菌,经PCR鉴定表明已获得了含重组的反义载体或干涉载体的农杆菌EHA105。
3 DAD1基因沉默载体的转化
以芥蓝带柄子叶、下胚轴与Flamingo-bill为外植体,建立了高效离体再生体系。带柄子叶在培养基MS+蔗糖3％+6-BA 2mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1+AgNO3 5mg·L-1中分化率最高,为94.0％;下胚轴在MS+蔗糖1％+6-BA 2mg·L-1+AgNO3 7mg·L-1培养基中分化率最高,为86.7％;Flamingo-bill在MS+蔗糖3％+6-BA 2mg·L-1培养基中出芽率为10096,平均出芽数为4.5个。利用三种外植体采用叶盘法转化,带柄子叶与下胚轴预培养2～3d,0D6000.2～0.5的农杆菌菌液侵染1～10min,Flamingo-bill不用预培养直接侵染10～30min,共培养3～4d,转入脱菌培养基或直接转到含Km或PPT的培养基中选择,分别获得15株Km抗性植株与28株PPT抗性植株。经PCR、PCR-Southern、Southern杂交表明反义载体与干涉载体中的目的片段均已转入芥蓝植株中。RT-PCR分析表明转基因植株DADl表达受到了抑制;转基因植株花粉的萌发率低,表现雄性不育。