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水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以大米作为主食。由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是水稻生产的主要限制因素之一，培育抗性品种是控制此病害最经济有效且对环境安全的手段。先前的研究证明，稻瘟病抗性基因Pish对中国及菲律宾的一些菌株具有抗性。本研究旨在开展Pish的定位及功能研究，主要开展了以下4个方面的研究工作： 1.稻瘟病抗性基因Pish的定位 利用2个对水稻品种Kasalath致病，但对水稻品种Shin2不致病的稻瘟病菌株CHL27与CHIA46分别接种由Shin2与Kasalath杂交获得的F2代群体。结果显示，F2代群体的抗性均符合3:1的抗感分离比，表明Shin2中对2个菌株的抗性分别由1个显性基因控制。与此同时，构建了由400个抗病以及131个感病个体组成的作图群体用于基因的分子定位。 采用混合群体分离分析法(bulked-segregant analysis，BSA)，选用180个平均分布于水稻12条染色体上的微卫星(simple sequence repeat，SSR)标记对构建的抗病基因池和感病基因池进行筛选及连锁分析，结果在第1染色体上有4个标记RM443、RM543、RM472-1以及RM104与抗性基因连锁，标记与抗性基因间的遗传距离分别为11.4、1.5、9.4和15.0 cM。为了精细定位Pish基因，筛选到5个多态性标记RMSh3、FPSM1、RM319、RM486以及38M11，把基因定位在38M11与FPSM1之间，两者与抗性基因的遗传距离均为0.1 cM。本研究继续在这个区域搜寻多态性标记，结果获得3个标记：FSTS1、38M15以及FSTS2，并最终将抗性基因定位于标记38M15与FPSM1之间，两者与抗性基因的遗传距离均为0.1 cM。 2.Pish物理图谱的构建及抗性基因预测 通过锚定所有用于基因精细定位的分子标记于日本晴的BAC/PAC克隆的重叠群上，然后通过Pairwise BLAST软件，分析克隆末端的重叠情况，把这些克隆进行了拼接，由此构建了包含Pish位点的克隆重叠群。使用基因结构预测软件RiceGAAS进行基因预测，结果发现在标记38M15与FPSM1之间有2个可能与抗病性有关的基因，它们都编码NBS-LRR蛋白，并分别命名为Pish-1和Pish-2。 3.Pish的克隆及遗传转化 为了验证Pish候选基因的功能，通过长片段PCR(long-range PCR，LR-PCR)技术扩增得到包含上游启动子及下游终止子的2个候选基因，并将它们组装到双元转化载体pCAMBIA1300，然后分别转入到感病品种Aichi Asahi中，对T0代转化苗进行了选择标记潮霉素基因的PCR检测及表型鉴定，结果表明Pish-2具有抗性功能；另外分别基于Pish-2的NBS及LRR结构域构建2个干涉载体，并将其转入携带Pish抗病品种Shin2中，结果转基因植株表现为感病表型，进一步确定Pish-2基因为Pish。 4.cDNA的获得及亚细胞定位 采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end，RACE)技术以及RT-PCR(reverse transcription-PCR)技术，获得了基因的全长cDNA序列，一共4774bp，编码由1123个氨基酸组成的NBS-LRR蛋白。以绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，eGFP)基因为报告基因，利用基因枪分别将构建的以CaMV35S作为启动子的Pish：：eGFP及eGFP：：Pish融合基因轰击进洋葱表皮细胞进行瞬时表达。蛋白的亚细胞定位结果表明，Pish定位于细胞质和细胞核中，表明Pish与稻瘟病菌的无毒蛋白可能在细胞质或细胞核内发生直接或间接的互作。