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本文通过HPLC-UV法检测木豆叶中球松素(5’-羟基-7-甲氧基-2-苯基色满-4-酮,pinostrobin)的含量,并通过正交设计实验对木豆叶球松素的超声提取条件进行优化;同时以成骨细胞MC3T3-E1为体外模型,研究球松素及木豆叶提取物对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及矿化等生物学活性并对其作出评价,研究结果如下:1.运用HPLC-UV方法,确定了测定木豆叶中球松素含量的检测条件,色谱条件为:色谱柱:HiQ sil C18W(4.6mmφ×250mm,5μm);流动相:(A)甲醇-(B)0.1%水(v/v),梯度洗脱条件为0-15min A:75%-70%,15-25 min A:70%-85%,25-40 min A:85%-75%;流速:1.0mL/min;柱温25℃;检测波长287nm。该方法的精密度和重复性的R.S.D.均小于3%。2.以木豆叶为原料,采用正交设计L9(34)对其各影响因素进行优化,确定最佳提取工艺参数其结果如下:甲醇浓度80%,提取时间60min,温度50℃,料液比1:40(g/mL),在此条件下的球松素的最大提取率为1.832mg/g。木豆叶球松素提取物具有较好的DPPH自由基清除能力,其IC50值为0.281mg/mL,与抗坏血酸的IC50值0.202 mg/mL相近。表明应用正交设计优化木豆叶中球松素的提取率安全可靠,球松素的甲醇提取物具有较好的抗氧化活性。3.运用MTT法研究球松素对成骨细胞MC3T3-E1增殖的促进作用,结果表明木豆提取物及球松素对成骨细胞MC 3T3-E1均有不同程度的影响,与阳性对照雌二醇相比,球松素的促进增殖效果更为明显,从时间和浓度梯度来看,40μg/mL球松素作用成骨细胞24h,对细胞的增殖有显著的效果,增殖率达到(26.27±0.95)%。4.利用硝酸还原法检测球松素对成骨细胞MC3T3-E1内NO含量的影响,结果表明球松素浓度为40μg/mL,作用MC3T3-E1成骨细胞24h后,球松素组的NO水平(63.15±2.15)μmol/L显著低于对照组(82.63±3.48)μmol/L(P<0.01)。该结果显示:球松素促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,可能与其维持低水平的NO有关。5.运用比色法研究球松素以及木豆叶提取物对成骨细胞MC 3T3-E1中ALP活性进行检测,结果表明,球松素、木豆叶提取物对成骨细胞的分化均有不同程度的影响,球松素及木豆叶提取物中球松素浓度为40μg/mL时,对成骨细胞MC3T3-E1作用4d时,对成骨细胞促进分化效果最明显,达到(37.022±1.638)U/gprot。说明在一定范围内成骨细胞的分化与作用时间及作用浓度成依赖关系。6.运用酶联免疫法检测球松素对成骨细胞MC3T3-E1中COL Ⅰ的含量,结果表明球松素浓度在10 μg/mL-40 μg/mL对成骨细胞内的COL Ⅰ的含量有不同程度的影响,其中在球松素处理5d后,与对照组相比,成骨细胞内的COL Ⅰ的含量显著增高,达到(6.207±0.256)ng/106。7.将球松素(10 μg/mL-40 μg/mL)分别作用于成骨细胞MC 3T3-E1 14d、21d、28d,采用VonKossa法对MC3T3-E1进行染色,结果发现,相同浓度球松素处理的细胞矿化结节数目,随着药物作用时间延长而增加,并于处理后28d矿化结节数最多,钙盐沉积面积增大;在球松素浓度为40μg/mL,对成骨细胞MC 3T3-El作用28d时,成骨细胞矿化结节数目达到(177.21±25.86)个,说明球松素对成骨细胞的矿化具有促进作用,并存在时间和浓度依赖性。8.利用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)对骨钙素基因(OC)的表达进行实时定量分析,用球松素处理成骨细胞24h,随着球松素浓度的升高OC基因的表达呈上调趋势。当球松素浓度为40μg/mL时,OC基因的相对表达量为对照组的8.3倍,表明球松素能够促进成骨细胞OC基因的表达。9.采用MTT法检测球松素、木豆提取物对地塞米松预处理的成骨细胞MC 3T3-E1增殖抑制的逆转作用,在地塞米松预处理组中分别加入球松素及木豆叶提取物,结果发现细胞增殖率均高于激素组而低于空白对照组。说明球松素及木豆叶提取物能够在一定程度上逆转地塞米松对成骨细胞增殖的抑制作用,并存在浓度依赖效果。10.运用比色法研究球松素对成骨细胞内ALP含量的影响,结果在地塞米松预处理组中分别加入球松素以及木豆叶提取物,发现成骨细胞MC 3T3-E1内ALP含量高于地塞米松组且低于对照组。其中球松素及木豆叶提取物浓度为40μg/mL,作用成骨细胞MC3T3-E14d后,球松素组ALP含量为(10.235±0.283)U/gprot,木豆叶提取物组ALP含量为(8.358±0.893)U/gprot。说明在一定浓度下球松素能抑制地塞米松对成骨细胞分化的抑制作用。本研究为木豆叶中球松素资源的开发利用提供了科学的依据。