论文部分内容阅读
冠状动脉疾病、简称冠心病（coronary artery diseasae,CAD）、是最常见的心血管疾病,也是全球第一的死亡原因和影响全球人类生存质量的重要危险因素。冠心病是由冠状动脉壁斑块（动脉粥样硬化,AS）的形成引起血管狭窄,从而导致心脏的血液、氧气和营养供应不足,进而引发胸痛（心绞痛）、呼吸急促、心肌梗塞（myocardial infarction,MI）、甚至心源性猝死。冠心病是一种常见的多基因遗传疾病,由遗传因素和环境因素以及两者相互作用共同导致。全基因组关联研究（genome-wide associaiotn study,GWAS）是研究复杂性遗传疾病主要的遗传学手段,有利于更加快速、可靠地发现疾病的易感位点或易感基因,为研究疾病的分子机理奠定遗传学基础,从而对未来临床预防、诊断及治疗具有深远的指导意义。世界各地的研究学者通过GWAS已经发现了近200个冠心病易感基因位点,包括位于9号染色体上研究最为广泛的ANRIL基因位点（编码一长非编码RNA;long noncoding RNA,lncRNA）和在中国汉族人群中首次发现的ADTRP/C6orf105基因位点（编码一Androgen-Dependent TFPI-Regulating Protein）。尽管这些位点的发现是近年来在冠心病遗传学研究方面取得的突破性进展,但只是解释了部分冠心病的遗传率,无法解释冠心病的全部遗传率。基因-基因相互作用有可能解释部分的遗传率,但是,目前基因-基因相互作用在冠心病的遗传研究中还没有重要的发现,诸多易感基因-基因相互作有待于进一步的研究,所以探讨基因-基因相互作用是认知和解释冠心病遗传病理机制的重要科学问题。该博士论文聚焦基因-基因相互作用,也就是通常所说的上位性（Epistasis）效应,描述了基因间的相互作用是如何影响表型,并可能对诸如冠心病的人类疾病的遗传研究产生深远的影响。本论文的研究目的是探索已发现的冠心病GWAS易感位点或易感基因之间是否存在基因-基因相互作用,并进一步探索其分子机制。本论文先从分子和细胞水平的功能研究入手,聚焦本实验室多年研究的位于9号染色体上冠心病易感位点的ANRIL基因,通过全基因组基因表达谱数据分析其下游的受调控基因、核实其调控关系、发现基因表达调控的分子机制并探索与冠心病发生发展相关的分子与细胞机制。然后,检查该下游基因的遗传变异是否与冠心病发病风险显著相关,或者是否也是位于冠心病相关的GWAS位点的基因。如是,再通过遗传学分析技术研究ANRIL基因和受其调控的下游基因之间是否存在基因-基因相互作用。该研究希望通过全基因组基因表达谱分析、分子与细胞水平的功能研究、再整合遗传学分析,可靠地识别出引起冠心病发生发展的基因-基因相互作用。在本文的前期研究中,通过分析基于芯片技术全基因组基因表达谱结果,鉴定了ANRIL基因干扰后受其调控的下游靶基因,包括表达下调的基因AHNAK2,CLIP1,CXCL11,ENC1,EZR,LYVE1,WASL和TNFSF10以及表达上调的基因TMEM100和TMEM106B。同时,集中研究了8个下调基因,发现ANRIL基因通过调控CLIP1,EZR和LYVE1基因影响与冠心病相关的内皮细胞功能活动。但是,对于上调的2个基因没有进一步的研究。因此,该研究项目聚焦在受ANRIL基因调控的上调基因TMEM100（编码一Transmembrane Protein100蛋白质）和TMEM106B（编码一Transmembrane Protein 106B蛋白质）,进一步验证它们与ANRIL的分子调控关系,并深入研究它们之间的相互作用的分子机制以及与冠心病发生发展的分子机制。内皮细胞（endothelial cell,EC）的功能异常是冠心病发生的主要因素。本研究采用两种不同的内皮细胞,即EA.hy926细胞（EC系）和人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）,分别用特异小干扰RNA（si RNA）或表达质粒转染细胞,利用q RT-PCR分析检测基因的表达水平,深入探索与冠心病发生直接相关的单核细胞粘附内皮细胞功能以及单核细胞跨内皮迁移的细胞活动过程,从而在分子和细胞水平可以初步确定冠心病易感基因之间是否存在相互作用。分子和细胞水平的基因相互调控或者相互作用不一定直接转换为遗传水平的基因-基因相互作用。因此,本论文在遗传学水平对ANRIL和其下游受调控的基因之间是否存在基因-基因相互作用进行详细分析。利用三个现有的大型冠心病GWAS数据库CADRDIo GRAMplus C4D、Gene ATLA和UK Biobank进行分析,研究位于TMEM100和TMEM106B两侧翼的100 kb基因组区域中的基因组变异是否与冠心病风险存在显著关联。本实验选择TMEM106B区域中的总共887个变异,对636539个样品进行遗传分析,结果表明位于TMEM106B的4号内含子中的变异rs11509880与冠心病的发病风险显著相关。同样的分析发现,TMEM100基因位点没有与冠心病风险显著关联的遗传变异。然后,本文对基于50万英国人群的UK Biobank的大规模群体样本数据进行分析,在343145独立样品中,ANRIL易感变异rs2383207和TMEM106B易感变异rs3807865有可靠的基因型分型数据,对这些数据的基因-基因相互作用进行遗传分析,发现它们之间存在显著的相互作用关系。因此,本研究通过全基因基因表达谱数据分析,分子与细胞水平的功能研究,再整合遗传学分析鉴定出首个与冠心病风险显著相关的GWAS遗传位点之间的基因-基因相互作用网络。该方法简单、直接,且有望拓展到其它人类疾病的基因-基因相互作用网络研究。此外,为进一步验证本论文提出的基因-基因相互作用网络研究新方法的可靠性,本文研究了另一对本课题组前期发现在分子水平存在相互作用的冠心病GWAS基因,即位于染色体6p24.1区域上的ADTRP基因和位于染色体1q41区域上的MIA3基因（编码一Melanoma Inhibitory Activity Family SH3 Domain ER Export Factor 3蛋白质）。通过对UK Biobank大规模群体样本数据的遗传分析,发现ADTRP和MIA3变异之间存在基因-基因相互作用。研究结果进一步显示,建立在基于全基因组基因表达谱数据分析,分子与细胞水平的功能研究,再整合遗传学分析的技术可以成功鉴定出基因-基因相互作用网络。本论文的具体研究结果如下:1.荧光定量实时PCR分析表明,敲低ANRIL转录本DQ485454的表达会显著上调TMEM100和TMEM106B的表达水平。内皮细胞功能研究表明,敲低ANRIL的表达水平,会影响引发冠心病的两个关键过程,即增加单核细胞与内皮细胞（ECs）的粘附和单核细胞的跨内皮迁移（TEM）,而敲低TMEM106B的表达水平则可以抵消这一作用。但是,敲低TMEM100的表达水平对于ANRIL的功能没有影响。2.通过高表达TMEM106B,可以抵消由ANRIL高表达时引起单核细胞对内皮细胞的粘附作用以及单核细胞的跨内皮迁移能力的减弱。但是,高表达TMEM100对于ANRIL的功能没有影响。因此,可以推断出TMEM106B（非TMEM100）是在ANRIL引发冠心病的细胞活动过程中的关键靶基因。3.通过对冠心病患者冠状动脉组织样本的研究发现,与ANRIL转录本DQ485454的表达相反,冠心病患者的冠状动脉组织样本中TMEM106B的表达水平比对照组高出2倍以上。但是,TMEM100的表达水平在冠心病组和正常对照组没有显著差异。上述结果表明,尽管TMEM100和TMEM106B都是ANRIL下游基因,但是只有TMEM106B与冠心病相关。4.通过CADRDIo GRAMplus C4,Gene ATLAS,UK Biobank大规模群体数据库分析,结果表明TMEM106B中的基因组变异位点与冠心病(p=1.9×10-8)的发生之间存在高度显著的关联,但在TMEM100中没有发现与冠心病显著相关联的遗传变异。进一步遗传分析显示ANRIL的易感变异SNP rs2383207和TMEM106B中的易感变异SNP rs3807865之间存在显著的基因-基因相互作用（p=0.009）。5.利用全基因表达谱,功能研究和遗传分析的正向遗传学方法,确定了另一对基因ADTRP中的易感变异SNP rs6903956与MIA3中的易感变异SNP rs17465637之间存在显著的基因-基因相互作用（p=0.005）。本论文的创新点包括:（1）位于染色体9p21.3的GWAS位点的冠心病易感基因一直无法确定,但本文的研究结果进一步支持ANRIL是位于染色体9p21.3的GWAS位点的冠心病易感基因。另外,本论文发现TMEM106B是位于染色体7q21.11的GWAS位点的冠心病易感基因。（2）首次发现冠心病GWAS易感基因位点之间存在相互作用。基因-基因相互作用有可能调控冠心病的发病风险。（3）首次揭示冠心病的基因-基因相互作用如何调控冠心病发生发展的分子机制,即在转录水平的互相调控。（4）在方法学上,首次提出可以利用全基因表达谱分析、基因表达调控、分子与细胞水平的基因功能研究、大型数据库的遗传研究,并将其整合起来从基因功能上和遗传学上发现复杂性疾病GWAS位点之间的基因-基因相互作用网络。综上所述,本项研究主要揭示了两对冠心病GWAS易感位点和基因之间存在显著的基因-基因相互作用网络,即ANRIL-TMEM106B和ADTRP-MIA3,为冠心病的发病机理提供了遗传结构和分子机制方面的重要信息。而且,本文发现一简单、实用且有效的鉴定冠心病GWAS易感基因位点之间是否存在相互作用的新策略,这一新策略同样可以扩展到人类其它常见复杂性疾病的研究中,对了解其基因间的相互作用及机制具有重要的借鉴意义。总而言之,本论文首次为研究这些易感基因之间的相互作用的分子机制是如何影响冠心病的发病风险提供重要依据,且为进一步探索冠心病易感基因的功能及其在冠心病发病机制中所涉及的生物学途径提供新的见解。另外,本项目的深入研究可以建立复杂性疾病的基因-基因相互作用网络,以此作为未来临床开发冠心病预防和治疗策略的重要目标。