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紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是多年生豆科牧草，北方寒冷的天气严重影响紫花苜蓿的产量。紫花苜蓿在寒冷冬季的存活率取决于根颈芽的数量和返青能力。为了研究紫花苜蓿抗寒性的分子机制，本研究利用高通量测序技术对紫花苜蓿根颈芽进行转录组测序分析，获得大量与抗寒相关的转录本。克隆钙信号相关的MsNCX和MsCML抗寒基因，并分析这两个基因在植物抵御非生物胁迫方面的功能。本研究主要结果如下: 1.转录组测序分析紫花苜蓿抗寒机制 利用Illumina平台对紫花苜蓿根颈芽进行转录组测序，获得与抗寒相关基因在转录水平的动态变化。获得响应冷冻胁迫的差异表达基因共5605个，其中1900个上调差异表达，3705个下调差异表达。GO注释分析发现，差异表达基因主要聚类在生物学过程的有机环状化合物代谢过程，氧化还原过程和单一生物代谢过程;细胞成分的细胞壁，膜蛋白等;分子功能的核酸结合，结合和催化活性等子集中。差异表达基因主要是转录因子和各种信号传导元件的关键基因。350个差异表达基因被注释为转录因子功能，属于AP2/EREBP、Hsfs、MYB、bHLH、WRKY、NAC、bZIP和MADS等转录因子家族。钙信号传导途径（如阳离子转运基因和类钙调素基因），植物激素信号传导途径和蛋白泛素化途径关键基因被富集，呈现出上调表达。参与代谢途径的基因也被富集，呈现下调表达。 差异表达基因表达模式分析结果表明，编码功能蛋白和调节蛋白的差异表达基因在紫花苜蓿冷适应和冷冻胁迫时期均上调表达，编码调节蛋白的差异表达基因在休眠期基因表达量高于冷冻胁迫时期。与冷冻胁迫时期相比，不是所有的基因在返青时期会被诱导。qRT-PCR结果与转录组测序结果相关性很高，验证了转录组测序数据的准确性。 通过qRT-PCR分析紫花苜蓿在连续两年越冬期的基因表达模式，结果显示，钙信号和和抗氧化酶基因在紫花苜蓿连续两年的越冬期基因表达模式相同，激素信号传导途径相关的基因在冷适应和冷冻胁迫时期表达趋势一致，返青期基因表达变化不同，说明钙信号相关基因在紫花苜蓿抗寒过程中起到重要作用。 2.紫花苜蓿MsNCX基因克隆和功能研究 克隆获得紫花苜蓿MsNCX基因，该基因具有一对Na+/Ca2+结构域，编码597个氨基酸的多肽，紫花苜蓿MsNCX蛋白与蒺藜苜蓿MtCAX蛋白同源。MsNCX基因在紫花苜蓿根，茎，叶中均有表达，在根中表达量最高;低温胁迫下，MsNCX基因在紫花苜蓿叶片中快速响应;根中MsNCX基因响应盐胁迫最剧烈;在干旱和盐碱胁迫下，根中MsNCX基因在胁迫6h表达量达到最高;根中MsNCX基因在ABA胁迫12h表达量达到最高。 构建pCBM-MsNCX植物表达载体，并对烟草进行遗传转化研究。通过草丁膦筛选，PCR和qRT-PCR检测，选取表达量较高的4个株系用于后续功能分析。过表达MsNCX烟草的抗寒性显著提高，表现为存活率较高，冷胁迫后MDA较低，抗氧化酶活性提高，积累较多的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖。与野生型相比，在盐和干旱胁迫下，转基因株系叶绿素含量降低较慢，超氧阴离子和过氧化氢含量较低;CAT酶活性显著提高，同时积累较多的渗透保护性物质，尤其是脯氨酸。盐胁迫下，转基因株系叶片中积累较低的Na+含量，较高的K+含量。转基因株系中胁迫响应基因表达量显著高于野生型，说明MsNCX基因可提高烟草抵御非生物胁迫的能力。 3.紫花苜蓿MsCML基因克隆和功能研究 克隆获得紫花苜蓿MsCML基因，含有一个EF-hand结构域，编码196个氨基酸的多肽，紫花苜蓿MsCML蛋白与鹰嘴豆CaCML45蛋白亲缘关系最近。MsCML基因在紫花苜蓿在茎中表达量最高，其次是根，表达量最少的是叶片。紫花苜蓿叶片中MsCML基因快速响应不同的非生物胁迫，结果如下，在冷和盐胁迫1h后MsCML基因表达量剧烈升高;在盐碱和ABA胁迫下，MsCML基因在胁迫3h表达量达到最大值;在甘露醇胁迫下，MsCML基因在胁迫24h表达量达到最大值，说明紫花苜蓿MsCML基因对非生物胁迫的早期应答过程起到重要作用。 构建过表达植物表达载体pCBM-MsCML，并对烟草进行遗传转化研究。通过草丁膦筛选，PCR和qRT-PCR检测，选取表达量较高的3个株系用于后续功能分析。过表达MsCML烟草的抗寒性显著提高，可以快速恢复冷胁迫造成的损伤，与野生型相比，经冷胁迫后叶片电导率和MDA较低，抗氧化酶活性提高，积累较多的脯氨酸和可溶性蛋白质。在盐和干旱胁迫下，转基因株系比野生型具有更高的叶绿素含量，超氧阴离子和过氧化氢含量较低;抗氧化酶系活性提高，同时积累较多的脯氨酸减少非生物胁迫带来的损伤。盐胁迫下，转基因株系叶片中Na+含量低于野生型，K+含量高于野生型。过表达MsCML基因的烟草胁迫响应基因的表达量明显高于野生型，说明MsCML基因可提高烟草抵御非生物胁迫的能力。