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骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤。采用手术、新辅助化疗等综合治疗方案后,疗效有了显著提高,但是仍有30%-50%的局部骨肉瘤终将复发；对于复发性和转移性骨肉瘤,目前尚无有效方法,疗效极差。尽管新辅助化疗结合手术已可将骨肉瘤患者的5年生存率提高到60%一80%,但近30年来患者的生存率始终没有进一步的提高。骨肉瘤的治疗现状促使科学家们探索新的致病机制和治疗手段,以进一步提高骨肉瘤的治愈率。自从上世纪80年代起,免疫治疗作为继手术、化疗、放疗之后第四大治疗模式获得越来越多的重视,被视为治疗恶性肿瘤的一道曙光。我们在之前的研究中发现,Vγ9Vδ2T细胞联合唑来膦酸在体内体外都可以有效杀伤骨肉瘤细胞,并详细研究了可能涉及的途径和机制。因而我们考虑将Vγ9Vδ2T细胞作为骨肉瘤免疫治疗的效应细胞,探索骨肉瘤免疫治疗的新路径。本次研究主要分三部分：一、我们检测分析了外周血单个核细胞在ZOL和IL-2刺激下,Vγ9Vδ2T细胞扩增表型的变化。我们发现,体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞经历了“量”和“质”的改变。在体外扩增的前期,Vγ9Vδ2T细胞的杀伤作用随着数量和比例的升高而逐渐增强,并在12天至18天达到峰值。此时的Vγ9Vδ2T细胞杀伤活性最强而细胞数量十分充足,细胞表型为效应细胞表型,适合作为杀伤肿瘤的效应细胞。二、我们研究了曲妥珠单抗TTZ介导的Vγ9Vδ2 T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用。我们发现,人类表皮生长因子受体2(HER2)的表达是TTZ结合到OS细胞上的先决条件,骨肉瘤U20S细胞系显示中度HER2表面表达,而HOS细胞系只有低度HER2表面表达。TTZ共培养在U20S细胞系中诱导ADCC,然而在HOS细胞系中(低HER2表面表达)没有观察到明显的ADCC效应。三、我们研究了曲妥珠单抗联合唑来膦酸刺激Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用。结果发现体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞具有ADCC潜能,并且它们的抗肿瘤活性可以显著地被单克隆抗体(monoantibody, mAb)共培养的肿瘤细胞所增强。TTZ是一种人源化的mAb,可以结合HER2的细胞外区域。Vγ9Vδ2T细胞联合TTZ和唑来膦酸可以对HER2阳性肿瘤细胞产生更大的细胞毒性作用。因此,我们的研究结果表明,Vγ9Vδ2T细胞联合ZOL具有抑制骨肉瘤的作用,而且这种作用可以被TTZ的联合应用所增强。这项研究可以提供Vγ9Vδ2T细胞过继性免疫治疗OS,联合使用ZOL和TTZ的理论依据,为骨肉瘤的多途径联合免疫治疗提供了实验基础。第一部分Vγ9Vδ2 T细胞的体外扩-增、纯化及表型鉴定目的：利用外周血单个核细胞扩增Vγ9Vδ2T细胞,分析不同时间点的表型及纯度,利用免疫磁珠纯化细胞。方法：将健康志愿者外周血单个核细胞使用Zol+IL-2刺激并体外扩增,流式细胞技术检测Vγ9Vδ2T细胞表型及纯度,用LDH法检测Vγ9Vδ2T细胞的细胞毒活性。结果：健康志愿者的外周血单个核细胞经过体外培养,Vγ9Vδ2T细胞纯度、杀伤活性逐渐增加,细胞表型由幼稚型向效应性转变。体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞经历了“量”和“质”的改变。12天到18天左右的Vγ9Vδ2T细胞杀伤活性最强而细胞数量十分充足,适合作为杀伤肿瘤的效应细胞。结论：体外扩增Vγ9Vδ2T细胞经历了“量”和“质”的改变,表型和杀伤能力检测均表明12天到18天左右的细胞杀伤活性最佳,适合作为杀伤肿瘤的效应细胞。第二部分曲妥珠单抗介导的Vγ9Vδ2 T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用目的：观察曲妥珠单抗能否增强Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用。方法：提取健康志愿者外周血单个核细胞,利用ZOL和IL-2体外扩增14天后,流式细胞技术检测Vγ9Vδ2T细胞纯度,并检测CD16在Vγ9Vδ2T细胞上的表达情况。检测骨肉瘤细胞表面分子HER2的表达水平。应用MTS法检测曲妥珠单抗刺激Vγ9Vδ2T细胞在体外杀伤骨肉瘤细胞系HOS和U20S的活性；流式细胞术检测共培养后Vγ9Vδ2T细胞CD107a和胞内细胞因子IFN-γ水平。结果：骨肉瘤U20S细胞系显示中度HER2表面表达,而HOS细胞系只有低度HER2表面表达。在4小时MTS中观察到在0-400μg/ml的浓度范围,TTZ无法单独抑制Os细胞的增殖,即使到72小时也一样。TTZ共培养在U20S细胞系中诱导ADCC,然而,在HOS细胞系中(低HER2表面表达)没有观察到明显的ADCC效应。结论：TTZ能够增强Vy9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用。在U20S细胞系可以诱发显著的ADCC效应,在HOS细胞系中没有诱发显著的ADCC效应。第三部分曲妥珠单抗联合唑来膦酸刺激Vγ9Vδ2 T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用目的：观察曲妥珠单抗联合唑来膦酸能否增强Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用,并进行Vγ9Vδ2T细胞杀伤骨肉瘤细胞的阻断机制研究。方法：提取健康志愿者外周血单个核细胞,利用唑来膦酸(ZOL)和IL-2体外扩增14天后,流式细胞技术检测Vγ9Vδ2T细胞纯度,并检测CD16、CD45RA、CD27在Vγ9Vδ2T细胞上的表达情况。检测骨肉瘤细胞表面分子HER2的表达水平。应用MTS法检测曲妥珠单抗联合唑来膦酸刺激Vγ9Vδ2T细胞在体外杀伤骨肉瘤细胞系HOS和U20S的活性；流式细胞术检测共培养后Vγ9Vδ2T细胞CD107a和胞内细胞因子IFN-γ水平。应用不同阻断剂分别阻断Vγ9Vδ2T细胞以观察其杀伤骨肉瘤细胞的机制。结果：我们模拟临床环境肿瘤细胞使用ZOL(可以达到肿瘤患者中16毫克ZOL输注达成的效果)预处理2小时,Vγ9Vδ2T细胞介导ZOL致敏U20S目标细胞的死亡率平均为32.0%,与单独ZOL预处理组的比值为5：1。TTZ增强了Vγ9Vδ2T细胞对ZOL致敏U20S的细胞毒性作用,此外,TTZ明显增强Vγ9Vδ2T细胞中的CD107a表达。这些数据表明,Vγ9Vδ2T细胞介导的杀伤作用,可以进一步通过TTZ和ZOL来提高。在共培养前30分钟将抗体加入到Vγ9Vδ2T细胞。使用CMA和抗泛γδT细胞作为效应细胞的治疗中发现,Vγ9Vδ2T细胞的细胞毒性是TCR依赖和穿孔素介导的(分别78.4%和83.4%的抑制率)。使用抗NKG2D抗体只能减少6.9%的细胞毒性作用,表明NKG2D不是TTZ和ZOL增强Vγ9Vδ2T细胞毒性作用的原因。结论：TTZ联合ZOL能够增强Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的体外杀伤作用,并且Vγ9Vδ2T细胞的细胞毒性是TCR依赖和穿孔素介导的,NKG2D不是TTZ和ZOL增强Vγ9Vδ2T细胞毒性作用的原因。