基于宏基因组学方法挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶资源

• 作 者: 梁跃斌
• 机 构: 山西大学
• 出 处: 山西大学
• 发表日期: 2017年01期
• 关键词: α-L-鼠李糖苷酶 肠道细菌 宏基因组学 保守氨基酸基序 简并引物

α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase EC3.2.1.40）属于糖苷水解酶类，能够专一、高效水解许多天然糖苷化合物如橙皮苷、芦丁、柚皮苷和槲皮苷等末端的α-L-鼠李糖基。据报道该酶可从细菌，酵母，真菌，植物和动物组织中分离获得，其应用价值在于能将果汁类饮品脱苦，去除饮品中的浑浊，增加酒的香气，可水解许多天然化合物的鼠李糖苷，作为药物前体来改善药物特性等等。　　本研究通过检索CAZy数据库，获得193条细菌源GH78家族α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列，经氨基酸一级序列同源性多重比对后，根据α-L-鼠李糖苷酶催化中心残基广义酸氨基酸的差异以及广义酸碱对处保守氨基酸基序特点，将其分为三个亚家族，对其中两个亚家族的α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列分别再进行多重序列比对，在各自广义酸碱对处分别获得两段保守氨基酸基序。　　利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法，以提取的健康人体粪便宏基因组DNA为模板，基于保守基序氨基酸序列设计简并引物，PCR扩增保守基序间基因片段。对PCR产物克隆测序，结果获得12条α-L-鼠李糖苷酶基因片段，将其编码的氨基酸序列在GenBank数据库进行Blast序列比对，其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52％，一条为73％，其余九条在94％以上。与GenBank数据库中序列一致性高(＞94％)的片段，根据其对应全长基因序列设计上下游引物，对于氨基酸序列一致性为52％的基因片段，通过对样品进行全基因组de novo测序，得其全长基因序列。将获得的四条α-L-鼠李糖苷酶全长基因，克隆于载体pET-28a，转化至E.coli BL21(DE3)进行异源表达。SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析表明，目的蛋白在上清和沉淀中均有表达。　　以对硝基苯酚α-L-鼠李糖苷(pNPR)为底物对获得的粗酶液活性进行初步检测，仅在RhaC目的蛋白的可溶性上清中检测到活性。随即利用镍柱亲和层析的方法，对其纯化条件进行摸索和优化，进而纯化得到高纯度的目的蛋白。　　综上所述，人体肠道细菌宏基因组为新型α-L-鼠李糖苷酶基因的挖掘提供了潜在的基因资源库，基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法，从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。