【摘 要】
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背景细胞的成骨分化是一个复杂的调控过程,涉及很多信号通路的参与。蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)为细胞信号通路中一种重要的激酶,可调节细胞的代谢、生长、增殖和分
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背景细胞的成骨分化是一个复杂的调控过程,涉及很多信号通路的参与。蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)为细胞信号通路中一种重要的激酶,可调节细胞的代谢、生长、增殖和分化等多个生理活动。多项研究表明PKC与细胞的成骨分化过程密切相关。但其是否在小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)的成骨分化过程中起作用以及起到什么作用,则很少有人研究。目的本研究旨在探讨不同亚型的PKC分子在小鼠BMSCs成骨分化中所起的作用,以期可以为骨质疏松症、骨肿瘤及骨损伤等临床疾病提供新的治疗靶点。方法1. BMSCs的成骨诱导：将80-90%融合度的第3代BMSCs进行铺板,添加终浓度为100 nM的地塞米松、50μM的L-抗坏血酸和10 mM的β-磷酸甘油二钠的成骨诱导培养基进行不同时间段的诱导,使BMSCs在体外向成骨细胞分化；2. Western印迹检测BMSCs成骨诱导中不同PKC亚型的活化情况并确定PKC阻断剂GF109203X (GFX)的最适作用浓度；3.采用茜素红染色、实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)及碱性磷酸酶活性检测实验等多种手段检测BMSCs的成骨分化情况,并借此确定那个(些)亚型的PKC分子参与了对BMSCs成骨分化的调节。结果1. Western迹结果显示小鼠BMSCs成骨诱导过程中PKCβⅡ、PKCδ、PKCμ PKCζ/λ均有显著的活化,而PKCα、PKCθ则没有明显的活化；2. Western印迹结果显示PKC阻断剂GFX的最适工作浓度为3μM,该浓度下的GFX可明显阻断BMSCs成骨诱导中PKCβ Ⅱ的活化；3.茜素红染色、qPCR及碱性磷酸酶活性检测实验均提示PKCβⅡ被阻断后,小鼠BMSCs的成骨分化水平得到了显著的增强。结论现有实验条件下,我们的实验结果显示PKCβ Ⅱ可能在小鼠BMSCs的成骨分化过程中起到了负调控的作用,对PKCβⅡ活性的特异性阻断可望为骨质疏松症、骨肿瘤及骨折等临床疾病提供新的治疗靶点。其它PKC亚型如PKCδ、PKCμ和PKCζ/λ是否在小鼠BMSCs的成骨分化过程中发挥作用,我们可在实验室具备相应条件时进行更深入的研究。
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