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本文采用紫外线遗传灭活的长牡蛎(Crassostrea gigas)精子诱导栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵子培育雌核发育二倍体,运用染色体分析、免疫荧光染色、微卫星分子标记等技术对雌核发育二倍体进行遗传学分析。主要结果如下:
1.诱导参数的筛选:运用L9(34)设计方法分析了不同6-DMAP浓度、诱导时机、诱导持续时间对雌核发育后代二倍体诱导率的影响。结果表明,6-DMAP浓度、诱导时机、诱导持续时间对异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体的诱导率有显著影响;早期胚胎畸形率与二倍体的诱导率呈负相关y=46.632-0.891x(r=-0.813)。综合考虑,确定6-DMAP诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体的最佳处理条件为:20-25%受精卵排放出第一极体时,以60μg/mL的6-DMAP持续处理25min,可获得29.5±5.36%的诱导率。依据研究结果,对栉孔扇贝异精雌核发育二倍体诱导过程中出现的非整倍体等现象进行了分析。
2.细胞学观察:采用多聚甲醛固定、免疫荧光染色方法,运用荧光显微镜对栉孔扇贝正常发育卵子和异源精子诱导的雌核发育卵子受精过程中微管的动态变化过程进行观察和分析。结果表明:
(1)正常发育组受精卵内以微管为基础的纺锤体能够顺利地组装并引导卵细胞进行减数分裂和第一、第二极体的排放,以及雌雄原核融合和第一次卵裂;
(2)异源精子诱导雌核发育的卵子经6-DMAP处理后,部分微管变得模糊或消失,纺锤体受到破坏导致染色体的分离无法正常进行,第二极体的形成受到抑制并使雌核染色体二倍化;去除6-DMAP作用后,微管重新组装,雌核分裂重新启动继而进行卵裂;精核保持固浓缩状态或轻微膨胀形成雄性原核,但卵裂后期则以致密的染色质体(DCB)形式存在于分裂沟上或进入一个卵裂球中。实验结果证实,长牡蛎精子经紫外线遗传灭活后可顺利进入并激活栉孔扇贝成熟卵子但不参与合子核的形成,6-DMAP可有效抑制第二极体的排放而获得雌核发育二倍体胚胎。
3.细胞、分子遗传学分析:运用GISH和SSR技术对诱导后代进行检测,GISH检测结果显示,诱导后代染色体全部来源子母本,没有父本染色体。通过优化PCR反应条件,在11对栉孔扇贝微卫星引物和10对长牡蛎微卫星引物中共筛选出3对引物,可以同时在长牡蛎和栉孔扇贝基因组中获得稳定性多态性较好的特异性扩增条带。利用筛选出的3对通用微卫星引物对雌核发育幼虫进行检验及遗传分析。结果表明,雌核发育个体基因完全来自于母本,幼虫中没有父本基因的表达;部分雌核发育幼虫在3个座位上发生了纯合,部分个体发生了不同程度的基因重组,3个座位上的重组率分别为40%、55%和35%。研究结果从分子水平上证实,利用遗传失活的长牡蛎精子诱导栉孔扇贝雌核发育是可行的,只进行一次第二极体抑制型雌核发育二倍体的诱导只能获得部分幼虫个体的基因纯合,但幼虫与母本具有高的遗传同质性。