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背景: 急性肺损伤是临床最常见的呼吸系统危重症之一,感染是该病的主要诱因。革兰阴性杆菌感染致急性肺损伤,主要是由于内毒素（LPS,Lipopolysaccharide）活化炎性细胞释放大量炎症因子所致。TLR4作为LPS靶细胞膜上的跨膜受体蛋白,其胞外的亮氨酸重复序列可以识别和结合LPS,而胞内与IL-1β同源的尾状结构域,为将LPS信号呈递给IL-1β提供了可能性,故TLR4是LPS信号转导的关键靶分子。TLR4的表达与功能完整直接影响LPS信号传导效能,反之,降低TLR4的表达与功能,有助于减少下游炎症因子的分泌与释放,以期减轻LPS所致的肺损伤。 肺泡巨噬细胞是呼吸道的重要防线,亦是LPS的主要效应细胞。研究其LPS信号通路及阻断效应,对帮助了解急性肺损伤的发生机制,寻找急性肺损伤治疗的新靶位,具有重要的理论与实际意义。 RNA干扰（RNA interference,RNAi）指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性将与之同源的mRNA降解成21nt～23nt的小片段,使相应的基因沉默。由于RNAi作用于RNA水平,故又称转录后基因沉默（PTGS）。近年来,在从真菌到植物,从无脊椎动物到哺乳动物等多种生物中都发现有RNAi现象。相对于传统的基因敲除,RNAi具有操作简单、周期短、效果明显等优点,因此人们利用RNAi技术开展了广泛的基因功能研究。随着RNAi技术在哺乳动物中应用的突破,越来越多的研究者开始关注RNAi技术在功能基因组学的研究和基因治疗研究中的作用。 为研究TLR4信号通路在LPS急性肺损伤中的作用与地位,本课题选择增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告分子,利用化学合成法siRNA建立了针对TLR4 mRNA的快速筛选siRNA体系,筛选出了能高效干扰TLR4mRNA的siRNA序列;在体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞中,分别在内毒素刺激前后予以siRNA,观察其对TLR4mRNA及下游炎症细胞因子表达的影响。在体外研究的基础上,我们还构建了可在体内表达shRNA的载体(pRNA-H1.rTLR4shRNA),体内转染后,再以LPS刺激,观察肺泡巨噬细胞TLR4 mRNA的表达或肺泡灌洗液中细胞因子的