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研究背景:癫痫(epilepsy)是一种由神经元突然异常放电所引起的反复发作的短暂的大脑功能失调的慢性疾病,是仅次于脑血管病的神经系统常见病。我国癫痫的患病率高,约为3.6‰-4.4‰,以16岁以下的儿童和青少年居多。20%-30%癫痫患者虽经正规抗癫痫药物治疗2年以上,仍然反复发作得不到控制,成为难治性癫痫(intractable/refractory epilepsy)[1]。儿童期是大脑功能迅速发育成熟的重要阶段,难治性癫痫治疗效果差,严重危害着儿童的身心健康。因此,开展儿童难治性癫痫的治疗方面的研究,探索治疗新靶点,具有重要的科学意义和临床价值。生酮饮食(ketogenic diet,KD)是一种高脂肪、低碳水化合物饮食方案,得名源于模拟禁食状态下形成酮症而产生酮体这一代谢过程,是目前治疗儿童难治性癫痫的重要方法之一[2]。1921年Wilder首次用KD临床治疗癫痫并显示了相对较好的疗效。大量临床研究和动物实验证实了 KD能够有效控制癫痫的发作,特别是针对儿童难治性癫痫的治疗,副作用小且疗效确切。临床随机调查发现:进行KD疗法3个月,75%的儿童癫痫发作减少[3-5]。关于生酮饮食的抗痫机制尚未完全阐明,近年来国内外研究提示可能与酮体的神经保护作用密切相关。但是,目前关于酮体神经保护的具体调控机制如何,尚不完全清楚。本课题分为两部分:一、通过HT22海马细胞系的培养,建立谷氨酸损伤HT22细胞模型并研究酮体的主要成分β-羟丁酸对谷氨酸损伤HT22细胞的神经保护作用。二、在氧化还原水平及细胞信号通路水平探讨β-羟丁酸神经保护作用的调节机制。第一部分β-羟丁酸对谷氨酸损伤HT22细胞具有神经保护作用目的：难治性癫痫仍然是临床治疗的重要且棘手的问题,难治性癫痫的患者可以选用高脂肪、低碳水化合物的生酮饮食(ketogenic diet,KD)予以治疗。近年来,生酮饮食在儿童难治性癫痫的治疗中取得了良好的效果,进行生酮饮食治疗时脂肪代替碳水化合物成为机体主要的能量来源,脂肪在肝脏氧化产生大量乙酰辅酶A(CoA),超过三羧酸循环能力,在肝脏线粒体内大量合成β-羟丁酸(β-hydroxybutyrate,BHB)、乙酰乙酸(acetoacetate,ACA)、丙酮三种酮体。低碳水化合物饮食情况下,机体能量主要来自酮体。大量临床研究和动物实验表明,KD治疗难治性癫痫能够显著提高血清和尿液中酮体β-羟丁酸的含量[6],提示β-羟丁酸可能在其抗痫机制中发挥关键作用,但具体机制尚不明确。本课题占酮体总量78%的β-羟丁酸为切入点,利用体外实验系统,通过建立谷氨酸损伤HT22细胞模型,分析β-羟丁酸的神经保护功能,来探讨β-羟丁酸的抗痫机制。方法:体外培养小鼠海马神经元细胞系HT22细胞,5mM谷氨酸(glutamate,GLU)处理HT22细胞24小时,建立神经细胞损伤模型,用MTT法检测不同浓度BHB预处理24小时对HT22细胞存活率的影响,以及不同浓度BHB预处理对谷氨酸损伤HT22细胞存活率的影响,倒置相差显微镜观察各组细胞形态,Hoechst33258染色荧光显微镜观察不同实验组细胞损伤情况。结果:1、分别用2mM,4mmM,8mM,lOmmM四种浓度的BHB预处理HT22细胞24小时,MTT法检测各组细胞存活率,与正常对照组及组间比较无统计学意义(P>0 05)。2、MTT法检测5mM的GLU处理组HT22细胞存活率降低明显,与正常对照组比较具有统计学意义(P<0.05);4mM的BHB预处理组细胞的存活率比GLU组高,与GLU组比较具有统计学意义(P<0.05),而8mM的BHB预处理组细胞的存活率比GLU组高,但与GLU组比较无统计学意义(P>0.05)。3、倒置相差显微镜进行形态学观察显示:正常对照组的细胞生长状态良好,细胞密度较大,数量多,细胞及细胞器完整,细胞核清晰;GLU组HT22细胞出现明显的凋亡状态,细胞密度低,数量少,细胞胞体皱缩,胞浆空泡多,核固缩,破碎,胞体及神经细胞突起断裂、破碎,可见凋亡小体;BHB预处理组细胞密度较GLU组大,数量较GLU组多,可见部分胞体肿胀,部分胞体皱缩,部分细胞细胞核固缩,凋亡小体较GLU组少见。Hoechst33258染色荧光显微镜下观察显示:正常对照组的细胞核为均匀的蓝色,密度大,数量多,细胞核清晰均质,颜色较暗;GLU组细胞核多为明亮的蓝色,稀疏,数量少,部分发白色光,核收缩,趋边,破碎;BHB预处理组细胞核多呈蓝色,密度较GLU组高,数量较GLU组多,部分为较明亮的蓝色,少数发白色光,可见少量核固缩,趋边。结论:1、2-10mMBHB处理对HT22细胞存活率没有影响,没有神经细胞毒性;2、GLU对HT22细胞具有损伤作用;3、BHB对GLU损伤的HT22细胞具有保护作用,BHB可能通过其神经保护作用在生酮饮食抗癫痫中发挥作用。第二部分β-羟丁酸神经保护作用机制的相关研究目的:神经损伤是难治性癫痫发生的重要机制,生酮饮食抗癫痫的机制尚不明确,我们推断与酮体有关。我们第一部分研究发现BHB具有神经保护作用,但是具体调控机制尚未完全阐明。一些动物研究表明,在低血糖的动物模型和帕金森的动物模型中,BHB可能在氧化还原水平发挥其神经保护作用[7,8]。通过前面的实验我们得知BHB对GLU诱导的海马神经细胞的氧化损伤具有保护作用,β-羟丁酸是否参与调节氧化损伤诱导的神经细胞损伤、凋亡,调控机制如何,本部分拟采用GLU神经细胞损伤模型,从氧化还原水平,细胞信号转导通路方面进一步研究β-羟丁酸的神经保护相关调节机制,从而深入了解KD的抗癫痫治疗机制,为临床提供科学依据,并为优化治疗策略提供线索和方向。方法:DCHF荧光探针检测各组HT22细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平;比色法检测各组丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,Western blot检测各组MAPK信号转导通路中P38MAPK与JNK通路蛋白表达水平。结果:1、DCHF荧光探针检测各组活性氧ROS产生情况,通过激光共聚焦显微镜下观察发现:正常对照组(Control组),视野暗,隐约可见暗绿色的细胞形态,细胞胞体完整,细胞膜连续;5mMGLU处理HT22细胞24小时组(GLU组),视野内可见较明亮的发绿色荧光的细胞胞体,部分细胞膜破碎,胞突断裂;4mMBHB预处理12小时后,5mMGLU损伤24小时组(BHB+GLU组),视野较暗,可见发暗绿色或者绿色荧光的胞体,少数发较明亮的绿色荧光;对相对荧光量水平进行量化分析发现:与正常对照组Control组相比,GLU组细胞ROS表达明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与GLU组相比,BHB+GLU组细胞ROS表达减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。2、各组丙二醛MDA含量的检测结果显示:1)Control组为正常对照组,GLU组为5mMGLU损伤12小时组,BHB+GLU组为4mmMBHB预处理12小时后,5mmMGLU损伤12小时组:GLU组MDA含量最高,与Control组相比,MDA含量明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);BHB+GLU组与GLU组相比,MDA含量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。2)Control组为正常对照组,GLU组为5mMGLU损伤24小时组,BHB+GLU组为4mMBHB预处理12小时后,5mMGLU损伤24小时组:GLU组MDA含量最高,与Control组相比,MDA含量明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);BHB+GLU组与GLU组相比,MDA含量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、Wetern blot检测各组P38和JNK的表达及磷酸化水平发现:Control组为正常对照组,GLU组为5mMGLU损伤组,BHB+GLU组为4mMBHB预处理12小时后,5mMGLU损伤组:GLU组P38磷酸化水平最高,与正常对照组Control组相比,磷酸化的P38水平明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),BHB+GLU组与GLU组相比,磷酸化的P38水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05);JNK表达及磷酸化水平趋势与P38一致。结论:1、BHB抑制GLU诱导的HT22细胞活性氧ROS和脂质过氧化物MDA的产生,从而在氧化还原水平起到保护作用;2、GLU通过升高MAPK通路中P38与JNK的磷酸化水平,通过激活P38与JNK通路发挥其对神经细胞的损伤;3、BHB降低MAPK通路中P38与JNK的磷酸化水平,提示BHB通过抑制P38与JNK通路参与调控对神经细胞的保护作用。