虫拟蜡菌漆酶的产生、酶学性质及其对木质素的降解特性研究

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生物质是地球上数量最丰富的可再生能源,具有重要的开发价值。它主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,其中木质素不仅难以被降解,而且它与半纤维素形成的复杂结构是阻碍生物质转化利用的主要屏障。同时木质素还是造纸行业排放的黑液的主要成分。因此,木质素的有效降解是生物质资源高效利用的关键。漆酶是木质素代谢过程中的关键酶,不仅能够氧化多种酚类和芳胺类化合物,还能氧化非酚类物质,因此在纸浆生物漂白、工业废水处理和有机染料脱水等众多领域,具有巨大的研究价值和应用潜力。  本研究利用N+离子注入等技术手段,诱变获得一株高产漆酶的Ceriporiopsissubvermispora NL4菌株,在此基础上又利用正交试验对其液体发酵产漆酶的培养基及培养条件进行了优化,明显提高了漆酶活力;研究了以竹粉为主要基质,外加营养物质对菌株固态发酵降解木质素的影响;又采用盐析、透析等手段对诱变菌株液态发酵所产的漆酶进行了分离、纯化,并研究了部分酶学性质,探讨了离子液体对纯化漆酶活力稳定性及其对漆酶降解木质素的影响,为离子液体环境下生物降解木质素提供了一定的理论和实践基础。主要研究内容如下:  (1)采用N+离子注入等技术手段,对虫拟蜡菌C.subvermispora进行诱变。结果表明:注入剂量为80×1014 ions/cm2、能量为30 keV的N+离子对C.subvermispora高产漆酶诱变效果最佳,获得了一株高产漆酶、遗传稳定性好的突变菌株NL4,其在发酵96 h后进入稳定期大量产酶,至第6d时酶活性达到最高0.377 U/mL,对应的生物量干重为4.14 g/L,漆酶活力是原始菌株的4.79倍。  (2)以菌株C.subvermispora NL4为研究对象,分别对液态发酵产漆酶的培养基成分和培养条件分别进行了优化。结果表明:最佳培养基成分为葡萄糖15 g/L、硫酸铵0.15%、Cu2+60μmol/L、阿魏酸50μmol/L,此条件下漆酶活力达0.881 U/mL,是培养基成分优化前的2.34倍。最优培养条件为培养温度28℃、初始pH5、装液量60 mL、摇床转速140 r/min、菌龄36h,此条件下漆酶活力达1.636 U/mL,是培养条件优化前的1.87倍。  在最佳培养成分和最优培养条件下,研究了菌株C.subvermispora NL4的生长及产漆酶的变化。与优化前相比,菌株提前一天达到最大酶活力,且酶活稳定在1.64 U/mL,是培养成分及培养条件优化前的4.35倍。  (3)以竹材渣为基质,对菌株C.subvermispora NL4固态发酵条件进行了研究,考察了将不同质量分数的玉米芯粉、麸皮、蔗渣和杨梅果渣加入到竹材渣中作为复合基质时,对C.subvermispora NL4漆酶活力和木质素降解率的影响。结果显示:在最佳培养基成分和培养条件下,C.subvermispora NL4在第10d达到最大酶活力32.4 U/g干基,是优化前的1.68倍;竹材渣中添加40%(w/w)杨梅果渣时作为复合基质进行固态发酵放大实验,经过10 d的降解,木质素降解率为18.7%,纤维素降解率为2.3%,木质素选择性系数为8.13;红外光谱分析表明,经过C.subvermispora NL4固态发酵后的竹材渣,其木质素的原始结构被破坏,其典型结构单元被降解成了小分子的亚甲基、羟基、羧基。  (4)对C.subvermispora NL4液态发酵所产漆酶进行分离纯化和部分酶学性质研究。经70%硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换柱层析、Sephadex G-100分子筛柱层析后,获得电泳纯的漆酶,该酶的分子量为63 kDa,纯酶比活力为245.27 U/mg;通过对该酶的酶学性质分析,结果表明该酶表现出典型的真菌漆酶特征,其Km值为23.3μmol/L,具有较强的底物亲和力,最适作用温度和pH分别为30℃和4.0-5.0,而且最适的pH范围内该酶的活力稳定性较好。  (5)研究了离子液体对漆酶活力稳定性及其对漆酶降解木质素的影响。结果表明漆酶在浓度为36%、pH值为5.0的[MMIM][CH3SO4]中具有最好的稳定性,处理4h后,其酶活力仍然保持在95%以上。木质素在30℃恒温条件下经紫外扫描发现浓度为36%、pH值为5.0的[MMIM][CH3SO4]溶解度是纯水中的6.1倍;红外光谱结果表明,木质素中羰基基团比处理前增加明显;13C-NMR谱图显示,CEL中的β-O-4中的Cγ信号减弱,而其中的Cα的信号增强,甲氧基含量增加,以上结果表明C.subvermispora NL4所产漆酶在离子液体中对木质素具有较好的降解效果。
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