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dsRNA病毒的复制与组装常常在一种称之为病毒包涵体或病毒加工厂(ViralInclusionBodies,VIBorViralFactories)的特殊细胞结构中进行。这种结构包含完整或不完整的病毒颗粒、病毒蛋白、dsRNA及细胞微管蛋白等组分。对哺乳动物呼肠孤病毒(Mammalianorthoreoviruses,MRV)和禽呼肠孤病毒(Avianorthoreovirus,ARV)的研究表明,非结构蛋白μNS在病毒加工厂的形成及病毒颗粒的组装中起着极其关键的作用。研究发现,在草鱼呼肠孤病毒(Grasscall)reovirus,GCRV)基因组中也编码有类似蛋白,即NS80。推测此蛋白可能在GCRV复制组装中行使与μNS相似的功能。本论文在GCRV非结构蛋白NS80原核表达与抗体制备基础上,对其功能进行了初步研究。论文共分三章:
第一章:引言。在简要介绍呼肠孤病毒的分类地位、理化性质、形态结构、基因组及病毒的生活周期等研究背景基础上,重点概述了MRV非结构蛋白μNS在病毒复制过程中包涵体结构形成及与其它蛋白相互作用的最新研究进展。同源序列分析显示,GCRV非结构蛋白NS80与MRVμNS病毒包涵体形成相关的功能结构域有一定的同源性,结合对相关研究领域进展的分析,提出了本论文的研究目的和意义。
第二章:草鱼呼肠孤病毒NS80及NS80335-742的表达纯化与抗体制备。GCRVNS80由742个氨基酸组成。基因序列同源性比对结果表明,草鱼呼肠孤病毒非结构蛋白NS80(特别是蛋白C端部分)可能在GCRV侵染细胞形成病毒发生基质方面起着关键性的作用。为研究NS80蛋白在GCRV复制组装中的作用,我们首先采用RT-PCR方法对编码NS80蛋白的基因组S4片段进行了扩增,通过克隆,在pRSETA载体中构建了NS80全长(pR/NS80)及NS80C末端(pR/NS80335-742)重组体。重组质粒在转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS细胞后得到了表达。经分析,转化菌株在28℃条件下达到最佳表达量。表达产物经His-tag系统纯化后免疫新西兰兔,制备得到特异抗血清。制备的两抗体的效价与特异性分别通过ELISA和Westernblot进行了检测分析。
第三章:草鱼呼肠孤病毒非结构蛋白NS80的功能分析。在上述NS80蛋白体外表达与抗体制备基础上,为进一步了解NS80在病毒感染中的作用,基于已建立的CIK(Ctenopharyngodonidelluskidneycells)细胞感染体系,首先对GCRV感染的不同时相的细胞分别收集,并同时进行了超薄切片和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)实验。透射电镜结果显示,感染GCRV的细胞质中出现大量的电子致密包涵体结构；此外,采用FITC(fluoresceinisothiocyanate)标记的NS80(335-742)特异性抗体的间接IF实验证实,在GCRV复制周期6-18小时,检测到NS80蛋白表达,其大量表达处于病毒侵染后期,即病毒包装时期。进一步的Westernblot实验在不同时相的病毒感染细胞裂解液中重复检测到NS80蛋白的表达。此外,为了进一步证明单一NS80在GCRV复制过程中能否形成包涵体结构,分别构建了NS80全长及C末端(335-742)在pEGFP-C1载体中的融合表达子,即pGFP/NS80和pGFP/NS80335-742,并在转染的Vero细胞中得到表达。荧光观测显示,pGFP/NS80及pGFP/NS80335-742均能在表达的细胞中产生类似病毒加工厂的球状结构,而pEGFP-C1空载的绿色荧光则均匀分布于整个细胞内,表明单一NS80蛋白或仅NS80335-742末端部分蛋白的表达具有形成包涵体的功能。其结果为进一步研究NS80在病毒复制中包涵体形成的功能域及与其它蛋白的相互作用奠定了良好的基础。