黄芪桂枝五物汤对心肌缺血再灌注损伤的相关实验研究

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目的:本研究欲通过观察黄芪桂枝五物汤(Huangqi Guizhi Wuwu Decoction,HGWD)对抗大鼠乳鼠心肌细胞的缺氧/复氧损伤的影响,探讨黄芪桂枝五物汤(HGWD)对心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)的保护的作用和相关机制。  方法:用Wistar大鼠乳鼠,建立其心肌细胞体外培养的缺氧/复氧的损伤模型。本实验一共分为6组:包括正常对照组,模型组,黄芪桂枝五物汤(HGWD)高剂量组、HGWD中剂量组、HGWD低剂量组,阳性药组。取Wistar大鼠雄鼠,正常组灌胃等量生理盐水;HGWD高剂量组、HGWD中剂量组、HGWD低剂量组分别灌胃等量高剂量(9.0g·kg-1·d-1)HGWD煎剂、中剂量(4.5g·kg-1·d-1) HGWD煎剂、低剂量(2.25g·kg-1·d-1)HGWD煎剂;阳性药组灌胃等量复方丹参滴丸溶液(0.075g·kg-1·d-1)。给Wistar大鼠灌胃3天,每天灌胃1次,在最后一次给药后的1h,取大鼠的腹主动脉的血液,离心过滤制备药物血清。使用含有不同浓度药物的低氧预处理1h的培养基,对各实验组心肌细胞进行缺氧/复氧损伤的模型的建立。观测缺氧/复氧后HGWD对心肌细胞生化指标的影响。对各组细胞进行HE染色,观察各组细胞缺氧/复氧损伤后的形态学变化。用流式细胞仪通过AnnexinⅤ/PI双染法测定缺氧/复氧损伤后HGWD对心肌细胞凋亡率的影响。用Realtime PCR检测HGWD对心肌细胞Bcl-2基因的mRNA和Bax基因的mRNA的表达的影响。用Western blot检测HGWD对心肌细胞的Bcl-2基因和Bax基因的蛋白的表达的影响。  结果:1.缺氧/复氧后,与正常对照组比较,模型组的心肌细胞的SOD活性降低,CK活性增强、NO含量和MDA含量均升高,P值均小于0.05;与模型组比较,HGWD高剂量组、HGWD中剂量组、HGWD低剂量组和阳性药组均能够增强心肌细胞的SOD活性,降低心肌细胞的CK活性、NO和MDA含量,且P值均小于0.05。  2.缺氧/复氧,对各组的心肌细胞进行HE染色,可见模型组大部分心肌细胞被破坏,结构不清、疏松排列,细胞的核或裂解,或浓缩,甚至消失;胞浆发生溶解,表明心肌细胞受到损害;HGWD中剂量和HGWD低剂量组的细胞亦有损伤,但严重程度不及模型组;阳性药组和HGWD高剂量组对细胞的保护作用明显,细胞的排列比较齐整,细胞的染色比较匀称,细胞的水肿和变性不明显。  3.缺氧/复氧,本实验中正常对照组的心肌细胞的凋亡率小于2.5%,与正常对照组比较,模型组凋亡细胞百分率是明显增高的,P<0.05;而与模型组比较,HGWD高剂量组、HGWD中剂量组、HGWD低剂量组和阳性药组的心肌细胞的凋亡率是明显下降的,P值是均小于0.05的。  4.缺氧/复氧,与正常对照组比较,模型组心肌细胞的Bcl-基因的mRNA的表达是减少的,Bax基因的mRNA的表达是增加的,P值均小于0.05;而与模型组比较,HGWD高剂量组、HGWD中剂量组、HGWD低剂量组的心肌细胞的Bcl-2基因的mRNA的表达有增加的趋势,Bax基因的mRNA的表达是减少的,P值小于0.05;阳性药组增加心肌细胞的Bcl-2基因的mRNA的表达,减少Bax基因的mRNA的表达,P值均小于0.05,对心肌细胞的保护作用较明显。  5.缺氧/复氧,与正常对照组比较,模型组Bax基因的表达是增加的,Bcl-2基因的表达是减少的,P值均小于0.05;而与模型组比较,HGWD高剂量组、HGWD中剂量组、HGWD低剂量组的心肌细胞Bax基因的表达是减少的,P值均小于0.05,Bcl-2基因的表达有增加的趋势,阳性药组能够减少Bax基因的表达,增加Bcl-2基因的表达,P值均小于0.05。  结论:黄芪桂枝五物汤(HGWD)能够增强缺氧/复氧后的心肌细胞的SOD的活性,降低CK的活性,减小NO含量、MDA含量,对MIRI的心肌细胞具有保护的效用。HGWD能够减少缺氧/复氧后的心肌细胞的凋亡数量,尤以HGWD高剂量组作用明显,和模型组有明显区别,起到保护心肌细胞线粒体结构的作用。HGWD能够下调缺氧/复氧后心肌细胞的Bax基因的mRNA和蛋白的表达、上调Bcl-2基因的mRNA和蛋白的表达,各给药组均和模型组有明显的区别,但比不上阳性药组,提示黄芪桂枝五物汤(HGWD),能够在MIRI的线粒体通路中发挥一定的心肌细胞的保护效用。
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