论文部分内容阅读
目的： 1阐述和发现重症中暑横纹肌溶解（Rhabdomyolysis,RM）的病变规律及可能机制，为临床成功救治重症中暑横纹肌溶解寻找可能的治疗切入点。 2从体内、体外水平进行重症中暑RM的治疗研究，为临床上寻找重症中暑RM治疗的“第二关键点”探索新的有效方法。 方法： 1收集既往重症中暑患者临床资料，研究重症中暑患者临床指标变化及危险因素分析。 ①收集归纳广州军区广州总医院既往10年140例重症中暑患者病例，其中男139例、女1例，年龄13-83岁，平均（27.7±12.9）岁。所有患者均在重症中暑发生后24小时内入院。其中死亡20例，存活120例。 ②对重症中暑患者病例进行单因素分析（包括年龄、CK、CK-MB、肌红蛋白、有否横纹肌溶解、CD14、PCT、C-反应蛋白、白细胞、中性粒百分比、血红蛋白、血小板、Na+、K+、Cl2－、Ca2+、P3+、BUN、CR、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、直接胆红素、PT、APTT、入院时GCS评分、MRI异常与否、发病时是否有谵妄或昏迷、乌司他丁使用与否、脏器衰竭数目、发病初始体温、降温后体温、入住ICU时间、总住院时间、APACHE（急性生理与慢性健康评分）Ⅱ评分、发病前有无身体不适、有无应用血滤等指标）及多因素logistic回归分析，找出临床上可能导致重症中暑患者死亡的危险因素。 2构建体外骨骼肌细胞（HMF）、血管内皮细胞（HUVEC）热应激损伤模型，从分子细胞水平研究不同刺激因素下，观察骨骼肌、内皮细胞的变化情况。 2.1热打击对骨骼肌细胞影响 2.1.1细胞培养。 2.1.2 CCK-8法检测热打击对HMF细胞活力和增殖的影响。 2.1.3双抗体夹心ELISA法测定热打击对HMF细胞释放炎症因子的影响。 2.1.4流式细胞仪联合Fluo-3钙离子内流检测热打击对HMF细胞膜通透性的影响。 2.1.5考马斯亮蓝R-250染色法检测热打击对HMF细胞骨架影响。 2.1.6流式细胞仪检测热打击对HMF细胞细胞周期改变。 2.1.7 CCK-8法检测乌司他丁对HMF细胞增殖的影响。 2.1.8双抗体夹心ELISA法测定乌司他丁对HMF细胞热打击条件下炎症因子释放影响。 2.2热打击对内皮细胞影响 2.2.1细胞培养。 2.2.2 CCK-8法检测热打击对HUVEC细胞活力和增殖的影响。 2.2.3双抗体夹心ELISA法测定热打击对HUVEC细胞释放炎症因子的影响。 2.2.4 PCR法测定热打击对HUVEC细胞释放IL-6、TNF-α的影响。 2.2.5考马斯亮蓝R-250染色法检测热打击对HUVEC细胞骨架影响。 2.2.6流式细胞仪检测热打击对HUVEC细胞细胞周期改变。 2.2.7 CCK-8法检测乌司他丁对HUVEC细胞增殖的影响。 2.2.8双抗体夹心ELISA法测定乌司他丁对HUVEC细胞热打击条件下炎症因子释放影响。 3从体内水平研究R M与炎症介质、肾功能及电解质变化的关系。 ①应用甘油诱导Wista大鼠制造横纹肌溶解模型。 ②观察应用乌司他丁对横纹肌溶解组及对照组大鼠血清肾功能、CK、电解质指标、炎症因子、组织病理切片表现。观察应用血必净对横纹肌溶解组及对照组大鼠组织病理切片的影响。 结果： 1收集既往重症中暑患者临床资料，研究重症中暑患者临床指标变化及危险因素分析。 从单因素分析来看，横纹肌溶解、肌酸激酶（CK）、Ca2+、PLT、GCS评分、脏器衰竭数目、APECHEⅡ评分、发病初始体温可能影响重症中暑患者预后。经过多因素logistic回归分析提示是否存在横纹肌溶解、脏器衰竭数目、APACHEⅡ评分可判断重症中暑患者预后。 2构建体外骨骼肌细胞（HMF）、血管内皮细胞（HUVEC）热应激损伤模型，从分子细胞水平研究不同刺激因素下，观察骨骼肌、内皮细胞的变化情况。 2.1热打击对骨骼肌细胞作用的研究 2.1.1对比正常对照组，骨骼肌细胞热打击组各个时相细胞活力均下降（P<0.001），并呈时间及温度依赖关系。 2.1.2骨骼肌细胞24h细胞增殖显示，随热打击程度的加深及作用时间延长，骨骼肌细胞的存活率下降，各时相均较正常对照组显著下降(P<0.001)，1h时段，三组热打击细胞存活率无显著差异（P>0.05），3h时段，43℃组细胞存活率较39℃及41℃组显著下降（P<0.01），至5h及7h，41℃和43℃组的OD值均接近阴性对照，两组均较39℃组显著下降（P<0.001），表明热打击对骨骼肌细胞具有细胞毒性，并呈温度及时间依赖性。 2.1.3 ELISA检查显示，同对照组相比，骨骼肌细胞热打击组IL-1β、IL-8、IL-10、γ-干扰素等无明显差异（P>0.05）。IL-6和TNF-α的表达量较正常对照组显著上升（P<0.001），41℃和43℃组较39℃组显著上升（P<0.01），43℃组和41℃组无显著性差异（P>0.05），骨骼肌细胞IL-6水平变化相对较明显。 2.1.4应用Fluo-3钙离子内流荧光检测试剂及流式细胞仪检测提示，同对照组相比，骨骼肌细胞随着热打击时间延长，细胞内钙离子内流增加。 2.1.5骨骼肌细胞随着热打击时间及程度加强，同对照组相比，显微镜高倍镜下可见细胞骨架逐渐出现变粗、变短，出现应力纤维。 2.1.6同对照组相比，骨骼肌细胞在热打击情况下，细胞周期出现阻滞，细胞被阻滞在G0/G1期，在约18h左右恢复正常。 2.1.7在离体状态下，0-7000U/ml等多种剂量乌司他丁对于骨骼肌细胞增殖无抑制作用（P>0.05）。 2.1.8相对于37℃对照组，给予3000U/ml乌司他丁共孵育1h后，将0h及6h组细胞上清检测炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ浓度，骨骼肌细胞在热打击1h后，0h组43℃热打击组IL-6较37℃对照组及43℃热打击+乌司他丁组明显升高（P＜0.05）、TNF-α明显升高（P＜0.05），但是， IL-1β、IL-8、IL-10、IFN-γ浓度在本实验中未检测到明显差别（P>0.05），见图3.9及表3.2。6h组各组IL-6有明显上升，但是43℃热打击组IL-6仍较37℃对照组及43℃热打击+乌司他丁组明显升高（P＜0.05），37℃对照组及43℃热打击+乌司他丁组无明显区别（P>0.05）。但43℃热打击组IL-8较37℃对照组及43℃热打击+乌司他丁组明显升高（P＜0.05），37℃对照组与43℃热打击+乌司他丁组亦有差别（P＜0.05）。43℃热打击组TNF-α较37℃对照组及43℃热打击+乌司他丁组升高（P＜0.05），其他炎症因子则因数值过低无明显实际意义。值得注意的是，6h组中37℃对照组同43℃热打击+乌司他丁组大部分炎症因子水平几乎无明显差别（P>0.05）。 2.2热打击对内皮细胞作用的研究 2.2.1对比正常对照组，内皮细胞热打击组各个时相细胞活力均下降（P<0.001），并呈时间及温度依赖关系。 2.2.2血管内皮细胞24h细胞增殖显示，经过不同程度热打击后，将细胞置于正常培养环境中培养24h后，CCK-8试验显示，相比正常对照（0h），39℃组1h、3h和5h时段热打击细胞24h增殖率无明显下降（P>0.05），7h时段显著下降（P<0.01）。41℃和43℃组各时相24h增殖率均较39℃组显著下降（P<0.001），43℃组3h、5h及7h时段24h增殖率较41℃组显著下降（P<0.01）。 2.2.3 ELISA检查显示，同对照组相比，内皮细胞热打击组IL-1β、IL-8、IL-10、γ-干扰素等无明显差异（P>0.05）。IL-6和TNF-α的表达量较正常对照组显著上升（P<0.001），41℃和43℃组较39℃组显著上升（P<0.01），43℃组和41℃组无显著性差异（P>0.05）。 2.2.4应用PCR检测，同对照组相比，内皮细胞热打击组IL-6和TNF-α的表达量较正常对照组显著上升。 2.2.5内皮细胞随着热打击时间及程度加强，同对照组相比，显微镜高倍镜下可见细胞骨架逐渐出现变粗、变短，出现应力纤维。 2.2.6血管内皮细胞在热打击情况下，细胞周期亦被阻滞在G0/G1期，在约12h左右恢复正常。 2.2.7在离体状态下，给予0-7000U/ml等多种剂量乌司他丁与血管内皮细胞共同孵育，发现乌司他丁对于血管内皮细胞增殖无抑制作用（P>0.05）。 2.2.8相对于37℃对照组，给予3000U/ml乌司他丁共孵育1h后，将0h及6h组细胞上清检测炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ浓度， HUVEC细胞在热打击1h后，0h组43℃热打击组IL-6较37℃对照组及43℃热打击+乌司他丁组明显升高（P＜0.05）、TNF-α明显升高（P＜0.05），但是，IL-1β、IL-8、IL-10、IFN-γ浓度在本实验中检测中浓度极低，无明确意义，见图3.19及表3.6。6h组43℃组IL-6有明显上升，43℃热打击组及43℃热打击+乌司他丁组IL-6浓度较37℃对照组明显升高（P＜0.05），但是，43℃热打击组较43℃热打击+乌司他丁组IL-6浓度明显升高（P＜0.05）。6h组43℃组TNF-α浓度较43℃热打击+乌司他丁组、37℃对照组升高明显（P＜0.05），IL-1β、IL-8、IL-10、IFN-γ浓度在检测中浓度极低，无明确意义。 3从体内水平研究RM与炎症介质、肾功能及电解质变化的关系。 3.1根据国内外相关文献，成功应用甘油诱导制造横纹肌溶解大鼠模型。 3.2同对照组相比，甘油诱导大鼠模型组出现横纹肌溶解引发IL-6、TNF-α、CK、CR、BUN等指标水平升高（P<0.05）。静脉应用乌司他丁可降低Wista大鼠IL-6、TNF-α、CK、CR、BUN等指标水平（P<0.05）。 3.3从病理切片来看，同对照组相比，静脉应用乌司他丁及血必净均可使横纹肌溶解缓解、肾损害减轻。 结论： 从临床病例回顾性单因素分析来看，是否存在横纹肌溶解、CK、Ca2+、PLT、GCS评分、脏器衰竭数目、APECHEⅡ评分、发病初始体温可能影响重症中暑患者预后。经过多因素logistic回归分析提示是否存在横纹肌溶解、脏器衰竭数目、APACHEⅡ评分可判断重症中暑患者预后。 肌肉组织中存在横纹肌细胞及内皮细胞等其他细胞组织，内皮细胞是多种炎症因子的靶细胞及效应细胞，所以，在本实验体外研究中同时研究热打击对内皮细胞的各种影响。热打击对骨骼肌细胞、血管内皮细胞具有细胞毒效应，能够抑制细胞的增殖，并促进细胞因子IL-6和TNF-α的释放，导致细胞钙离子内流增加（横纹肌溶解发生的诱因之一）、细胞骨架改变、细胞周期阻滞，多种作用最终导致细胞结构和功能随之发生改变。 乌司他丁对两种细胞无增殖抑制作用。在离体热打击情况下，乌司他丁抑制两种细胞的炎症因子释放。而通过对甘油诱导的横纹肌溶解Wista大鼠研究发现，静脉应用乌司他丁治疗可减少横纹肌溶解Wista大鼠炎症因子释放水平，使CK、肾功能指标好转，对机体起到保护作用。而静脉应用血必净治疗可减少横纹肌溶解Wista大鼠横纹肌、肾脏损害，对机体起到一定的保护作用。