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沈抚灌区是我国面积最大、污灌历史最长的石油污水灌区,土壤中多环芳烃(PAHs)污染物严重超标。实验室前期工作发现,鞘氨醇单胞菌可能为灌区土壤中修复PAHs污染的关键功能菌群。鞘氨醇单胞菌是1990年划分的一个新属,因其生态分布广泛且PAHs代谢途径独特,逐渐成为环境微生物学领域关注的一个热点研究对象。但是,如何从生态学角度调查环境样品中鞘氨醇单胞菌属的丰度、多样性和种群结构,并探讨其与环境因子的关系却鲜见报道。
本论文首先根据鞘氨醇单胞菌属16S rRNA基因序列设计了三对非简并鞘氨醇单胞菌属-特异性引物,分别通过与数据库保存的大量鞘氨醇单胞菌序列比对、引物对纯培养菌株的选择性和构建环境样品(4个石油污染样品)克隆文库以及扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)三个水平验证引物特异性,并与一对已报道的鞘氨醇单胞菌属-特异性引物SR/108f-420r进行比较。结果表明,新设计的引物SA/429f-933r能够比其它引物从沈抚灌区石油污染土壤中检测更多的鞘氨醇单胞菌。
本论文首次应用实时荧光定量PCR技术研究鞘氨醇单胞菌在石油污染土壤中的丰度。结果发现,沈抚灌区15个石油污染土壤都含有鞘氨醇单胞菌。鞘氨醇单胞菌在旱田土中占总细菌的比例显著高于其在稻田土中的比例(P<0.05)。鞘氨醇单胞菌的丰度与PAHs/TPH呈正相关(r=0.672,P0.05)。DGGE图谱中优势条带切胶测序结果表明,这些条带均为鞘氨醇单胞菌,但不同土壤中的优势菌株不同。
建立了一种从土壤中有针对性地、快速分离可培养鞘氨醇单胞菌的方法,即根据鞘氨醇单胞菌能够产黄色素和抗链霉素的生理特征,结合属特异性引物-PCR法从沈抚灌区石油污染土壤中分离鞘氨醇单胞菌。沈抚灌区15个石油污染土壤,只有12个土壤出现抗链霉素的黄色菌落,黄色菌落数量与PAHs/TPH呈显著相关(p<0.05)。从抗性平板上随机挑取60个黄色菌落和7个非黄色菌落,提取这些菌落的基因组DNA并用属.特异性引物SA/429f-933r进行扩增,阳性PCR产物经ARDRA和DGGE遗传分型,得到8个不同的遗传型。其中,7个遗传型是鞘氨醇单胞菌,1个遗传型为赤细菌(Erythrobacter)。
采用以PAHs为唯一碳源的双层平板法,从上述分离到的7株鞘氨醇单胞菌中筛选到6株芴降解菌。在30℃,芴浓度为100 mg L-1的条件下,菌株4c经7天对芴的降解率最高,为87.2%。在相同条件下,菌株4c对菲的降解率为64.8%。