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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)于1983年由Marshall等成功分离。近年来,大量研究及临床检测都显示Hp是慢性胃炎和十二指肠溃疡等疾病的主要致病菌,也是引发胃癌的潜在因素。目前临床上对Hp感染患者普遍采用国际标准的三联疗法(STT)治疗,其根除率能达到90%。但该疗法有较大副作用,同时也可能导致Hp产生耐药性,进一步加剧治疗难度。在本课题的前期研究基础中,已从33株益生菌菌株中筛选出1株枯草芽孢杆菌(KM)发酵上清液对Hp具有很强的体外拮抗作用。由于枯草芽孢杆菌胞外能分泌多种活性物质,而找到针对Hp的抑菌活性物质则是本研究的出发点之一。为了得到高纯度的抑菌活性物质用于后续结构鉴定,本实验将Hp国际标准菌株NCTC 11637作为指示菌,对拮抗Hp抑菌活性物质进行分离纯化。我们通过对多种层析柱进行比较选择(包括阳、阴离子交换层析、疏水层析、RP-HPLC等),并对多种缓冲条件进行比较和优化,确定了一套实验室规模纯化策略将活性物质分离出来,得到纯度达到98.86%的活性物质纯品。此外,由于后续抑菌机理的研究以及细胞水平评价实验需要大量的活性物质。因此,形成另一套小试规模纯化工艺,活性物质样品的获得量从原来μg级上升到mg级(每升上清液能得到0.56 mg纯品),且纯度高于90%,且最大限度保留其活性。得到足量的活性物质之后,再通过质谱分析、氨基酸组成分析、N-末端氨基酸测定、Edman降解法序列测定等方法对该样品的化学结构进行进一步分析。结果表明此活性物质精确分子量为3402.524,是由30个左右氨基酸组成的多肽类物质,命名为抗菌肽AMP-km。其二级质谱、N-末端氨基酸序列测定、蛋白酶敏感性实验结果均提示此抗菌肽具有环状结构;圆二色谱分析显示其二级结构主要由α-螺旋组成。理化性质研究表明:AMP-km具有热稳定性(100℃加热5min后失活),宽p H值适应性(2.0-8.0),并且对胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶E等蛋白酶不敏感。提示其具有很强的环境适应性。此外,对AMP-km的抑菌谱研究表明:AMP-km除了对3株Hp国际标准菌株具有很强抑制作用外,还对革兰氏染色阴性菌——铜绿假单胞菌以及革兰氏阳性菌——单核增生李斯特菌等致病菌也具有较强抑制作用,提示AMP-km具有更广泛的应用前景。此外,本实验从细胞水平评价了AMP-km对Hp感染胃癌细胞的体外拮抗效果。先用AMP-km处理Hp再感染细胞,再分别观察细胞形态、Akt磷酸化水平及PARP-1剪切程度等多项指标,发现AMP-km处理之后的Hp感染胃癌细胞的能力显著下降。另一方面,对已经Hp感染的胃癌细胞以AMP-km处理一定时间,能显著降低Hp感染造成的细胞凋亡效应。说明AMP-km在拮抗Hp感染细胞方面起作用,并且此拮抗作用与其作用时间呈正相关。抑菌机理研究方面:通过透射电镜的观察发现AMP-km并不影响Hp细胞的完整性,荧光共聚焦显微镜研究共价联接Dy Light 488的AMP-km,发现其能进入到Hp细胞质中,且不破坏细胞的完整性。荧光共定位研究发现AMP-km与Hp的基因组DNA共定位。另外,凝胶阻滞实验证实AMP-km能结合到Hp的DNA上。进一步对加与不加AMP-km处理的Hp转录组进行RNA-seq测序分析发现,AMP-km能抑制与同源重组、错配修复、转运、RNA的表达和降解及蛋白翻译等功能相关基因的表达。其中Hp的DNA损伤修复相关基因Rec A的表达显著降低。另外,比较蛋白质组学研究(i TRAQ高通量质谱)进一步证实了该基因蛋白水平的表达也受到抑制。因此,AMP-km能在不破坏细胞膜的情况下进入到宿主细胞中,结合到DNA上,影响宿主细胞DNA损伤修复、RNA转录和蛋白翻译等功能基因的表达,进而对宿主细胞造成重要影响。本研究分离纯化得到拮抗Hp的抗菌肽纯品;对其结构进行鉴定;理化性质研究;细胞学评价以及抑菌机理的研究。初步完成了从发现、获得、认识,到探索应用等一系列过程,为此AMP-km能作为治疗Hp感染的候选药物打下理论基础。