【摘 要】
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脂肪酶是一种重要的工业用酶,已被广泛地应用于洗涤剂、食品、油脂加工、药物合成、化妆品、造纸和生物柴油制备等领域。铜绿假单胞菌脂肪酶具有较高的活性、稳定性和选择性
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脂肪酶是一种重要的工业用酶,已被广泛地应用于洗涤剂、食品、油脂加工、药物合成、化妆品、造纸和生物柴油制备等领域。铜绿假单胞菌脂肪酶具有较高的活性、稳定性和选择性等特性,但该脂肪酶的活性构象的形成依赖于其特异性的折叠酶。为了进一步提高铜绿假单胞菌脂肪酶的应用价值,本课题开展了铜绿假单胞菌脂肪酶的表达及其诱导条件优化、铜绿假单胞菌脂肪酶的分子定向进化、基于分子对接的铜绿假单胞菌脂肪酶的点饱和突变和重组脂肪酶的纯化及其催化合成澳栗精胺衍生物等方面的工作。论文主要内容分为四个部分。(1)利用双元表达质粒pACYCDuet-1,铜绿假单胞菌CS-2的脂肪酶及其折叠酶基因成功地进行了共表达,其中最佳诱导条件为:诱导时间6h,IPTG浓度1.0mM和诱导温度37℃。(2)利用易错PCR的定向进化方法,通过初筛和复筛成功得到9个脂肪酶突变体。和野生型脂肪酶相比,脂肪酶突变体R314Q、S187N/E200G/R314Q和P104S的活性提高效果最为显著,分别是原来的1.65倍、1.62倍和1.54倍。(3)采取一种基于底物和酶分子对接的虚拟筛选方法得到了脂肪酶突变体R314W。脂肪酶突变体R314W活性为野生型脂肪酶的3.97倍。(4)用亲和层析法成功地纯化了野生型脂肪酶和脂肪酶突变体R314W,其纯度达到电泳纯。将纯化的野生型脂肪酶用于合成澳栗精胺衍生物,其中澳栗精胺的转化率为95.3%,6-O-丁酰澳栗精胺的得率为76.4%。将纯化的脂肪酶突变体R314W用于合成澳栗精胺衍生物,其中澳栗精胺的转化率为96.7%,6-O-丁酰澳栗精胺的得率为90.5%。
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