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头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一，在近40年运用传统标准方式治疗(外科手术、放射治疗和化学治疗)，其5年的生存率并没有显著地提高。鳞癌细胞能利用其分子策略逃避宿主有效的免疫反应。这可能与正常鳞状上皮恶变过程中产生多种免疫抑制产物来影响免疫功能有关。自然杀伤(NK)细胞是天然免疫系统中首要的效应者，在抗感染和肿瘤监视方面起了很重要的作用。在某一状态下NK细胞利用自身的受体与靶细胞上的配体结合诱导其活化。然而从癌症患者身上提取的NK细胞其抗肿瘤的的能力受到很大的影响。Toll样受体(TLRs)家族在人类共发现10类受体，能识别病原微生物中保守分子，从而启动天然免疫反应。近年来有资料显示polyI：C(人工合成的dsRNA)能上调NK细胞的自然的和CD16介导的细胞毒作用。polyI：C是Toll样受体3(TLR3)的配体，TLR3的刺激能快速上调体内NK细胞的功能。然而在肿瘤微环境中NK细胞TLR的蛋白表达水平如何，通过相应的配体刺激能否激活NK细胞，被激活的NK细胞的生物学行为又如何体现，目前未见报道。本课题由三部分组成，着重研究TLR3在NK细胞内的表达定位及头颈部鳞癌对其影响。第一部分人类NK细胞TLR蛋白表达及其受HNSCC的影响研究TLR在NK细胞中蛋白表达及其是否受HNSCC的影响。利用磁珠分离技术从正常人的外周血中获得NK细胞：采用Western blot检测人类NK细胞的TLR的蛋白表达；NK细胞与正常培养基和HNSCC细胞株(BHY、PCI-1和PCI-13)上清液培养24小时，再通过Western blot检测其TLR的蛋白水平的表达。结果显示：1．运用密度梯度离心法和磁珠分离技术能从健康人的外周血中获得高纯度的NK细胞。2．在TLR1-10中，人类NK细胞只有TLR1、2、3和7蛋白表达。3．在上述三种HNSCC肿瘤细胞株上清液和标准培养基中培养24小时的NK细胞中，各组均只有表达TLR1、2、3和7，并且表达强度无差异，因此提示TLR在NK细胞中的蛋白表达并不受HNSCC的影响。第二部分人类NK细胞TLR3表达定位研究了LR3在NK细胞中的表达定位，以及进一步了解polyI：C对其作用。利用流式细胞仪检测TLR3在NK细胞中的表达定位：NK细胞经polyI：C刺激后，用流式细胞仪测CD69的表达，并且通过Western blot了解NF-κB的活化程度；利用anti-TLR3 mAb功能性封闭NK细胞表面的TLR3受体，然后用polyI：C进行刺激，最后通过流式细胞仪和Western blot测定NK细胞的CD69的表达。结果显示：1．TLR3在天然的人类NK细胞中主要表达在细胞表面，有少量位于细胞内。2．Poly(I：C)的刺激可以导致NK细胞表面CD69表达的显著上调。3．经功能性封闭后再用polyI：C刺激的NK细胞CD69表达MFI为687±102，与正常的NK细胞CD69表达(MFI=532±78)无显著性差异，P＞0.05；该结果与Western blot显示的CD69的蛋白表达相一致：说明封闭NK细胞表面的TLR3后，polyI：C刺激不会导致CD69表达的明显上调。4．在正常培养基中经Poly(I：C)刺激的NK细胞，在60分钟这个时间点可以测得IκBα降解，在90分钟时发现IκBα降解得更加完全。这一结果符合TLR3受刺激后导致NF-κB的活化。第三部分HNSCC对人类NK细胞TLR3表达定位的影响讨论HNSCC细胞株的上清液对TLR3在人类NK细胞中表达定位的影响。将NK细胞与HNSCC细胞株(BHY、PCI-1和PCI-13)上清液培养24小时，利用流式细胞仪检测TLR3在NK细胞中的表达定位，然后用polyI：C刺激上述NK细胞，再用流式细胞仪测TLR3的表达定位和CD69的表达；将质粒pUNO-hTLR3转染到小鼠纤维母细胞NIH3T3中，使其表达异源性的TLR3，然后将其与HNSCC细胞株(BHY和PCI-1)上清液培养24小时，利用流式细胞仪检测该细胞中TLR3的表达定位；通过ELISA分析HNSCC细胞株(BHY、PCI-1和PCI-13)上清液的细胞因子的含量。结果显示：1．NK细胞表面的TLR3在正常培养基中明显高于在肿瘤上清液中，经t检验，P＜0.01；而在NK细胞内的TLR3在正常培养基中则明显低于在肿瘤上清液中，经t检验，P＜0.01。在各HNSCC细胞株上清液之间，NK细胞的TLR3表达无显著性差异，经t检验，P＞0.05。提示肿瘤上清液能使表达在细胞表面的TLR3出现快速地下调，相对应地在其细胞内的TLR3蛋白水平上升。这种TLR3“内化”现象也同样存在于表达异源性TLR3的小鼠纤维母细胞中。2．HNSCC细胞株上清液和Poly(I：C)两者具有拮抗效应；在肿瘤微环境中PolyI：C的刺激能使NK细胞表面TLR3的表达显著地增加，故提示Poly(I：C)能削弱HNSCC诱导TLR3在NK细胞中的“内化”；并且Poly(I：C)的刺激可以导致NK细胞表面CD69表达的显著上调，这种NK细胞的活化不受HNSCC上清液的影响。3．在所测定的细胞因子中IL-6和IL-8在上述三种细胞株中均大量分泌。在BHY上清液中IL-6为3750±265pg／ml，在PCI-1和PCI-13中分别为340±52pg／ml和450±78pg／ml。IL-8在BHY、PCI-1和PCI-13的上清液中的含量分别为820±111pg／ml、200±21pg／ml和760±72pg／ml。而其他的细胞因子在上清液中含量极其低，处于0～3pg／ml水平。因此，我们推测HNSCC细胞株分泌的IL-6和IL-8参与了诱导NK细胞TLR3的“内化”。总结1．采用免疫磁珠法的MACS技术可以从外周血中分离提取高纯度的NK细胞，这一方法值得信赖。2．在人类天然NK细胞中，只有TLR1、TLR2、TLR3和TLR7蛋白表达，并且表达是稳定的，不受HNSCC的影响。3．TLR3主要表达定位于人类天然NK细胞的细胞表面；polyI：C刺激细胞表面的TLR3激活NK细胞，使其CD69表达显著上调，上述过程依赖于NF-κB的活化。4．HNSCC造成NK细胞表面的TLR3迁移至细胞内；这一现象在表达异源性TLR3的纤维母细胞上得以证实。这种TLR3在NK细胞中的“内化”，暗示了NHSCC免疫逃逸的新机制。5．polyI：C不仅能削弱HNSCC诱导TLR3在NK细胞中的“内化”，而且能激活受HNSCC影响的NK细胞。6．HNSCC可能分泌某些细胞因子，如IL-6和IL-8，参与诱导NK细胞TLR3的“内化”。