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实验背景:慢性粒细胞白血病是常见的一种血液系统恶性癌症,导致其愈后效果不好的一大因素是细胞对化疗药物的耐药性。目前,寻求新型治疗技术是该疾病治疗的重点发展方向。微纳介质磁感应热疗技术可应用于血液肿瘤治疗领域,并且能够在体外很好的抑制人白血病细胞的生长,但其诱导凋亡产生的作用机制还不是特别清楚。已知细胞穿膜肽可以携带Fe304纳米粒子进入到细胞中,而线粒体跟细胞核又是细胞中非常重要的两个细胞器,因此我们推测,将磁性纳米粒在线粒体和细胞核富集有利于增强磁感应热疗效果。我们将CPPs穿膜序列与线粒体和细胞核的定位序列相结合,设计出线粒体和细胞核靶向定位的多肽序列,引导磁性纳米粒在细胞内靶向定位。实验目的:1.探讨磁感应热疗技术诱导耐药白血病K562/G细胞凋亡的可能性并探讨其作用机制。2.制备信号肽耦联的磁性纳米粒并在细胞水平探究该纳米粒应用于磁感应热疗的安全性和有效性。实验方法:1.应用耐药白血病K562/G细胞为实验对象,以不锈钢空心球为介质,300kHz,40Gs的磁场条件下43℃热疗30min,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,线粒体内膜电位(△ψm)的变化以及细胞周期的阻断情况,探究K562/G死亡是否由凋亡引起;设置43℃,47℃,50℃对细胞进行磁感应热疗,采用比色法检测 Caspase-3,8,9 的活性;Western blotting 分析了 Hsp70 蛋白及β-catenin 蛋白的表达情况;采用免疫荧光法比较Bax/BCl-2比值的变化。2.设计合成RM,RN,TM以及购买鱼精蛋白四种信号肽,共沉淀法合成Fe304纳米粒,在其表面耦联以上四种靶向多肽。采用透射电镜、傅立叶红外光谱仪、Zeta电位分析仪进行物理表观的检测,并绘制磁滞回线。细胞与Omg/mL,8mg/mL,16mg/mL,24mg/mL四种浓度的靶向Fe3O4纳米粒共孵育,24h后MTT法检测合成纳米粒的细胞相容性,使用ICP光谱仪测定共孵育后细胞对纳米粒的吞噬情况,共聚焦显微镜确定粒子的靶向性,最后MTT法检测相同温度下信号肽修饰后的纳米粒子体外升温并抑制细胞增殖的情况。实验结果:1.35、30、25、20、15mg/mL浓度的不锈钢空心球在300kHz、40Gs的磁场下温度升高情况随浓度而增加。MTT法检测空心球24h,48h,72h的细胞毒性较小,细胞相容性较好。细胞在交变磁场下加温30min,43℃细胞的增殖率为73.46±2.60%,47℃细胞的增殖率为66.77±2.34%,5℃细胞的增殖率为55.66±3.24%,磁感应热疗可以很好的杀死以及抑制K562/G细胞的增殖。流式细胞仪检测43℃磁感应热疗30min后,K562/G的凋亡率达到了 39%;线粒体膜电位发生去极化的细胞所占的比例由10.2%增加到了 70.8%;细胞的周期被阻断在G2/M期。磁感应热疗后第24h检测Caspase3,8,9的酶活均显著增强,并且随着加热温度的升高,更多的Caspase3,8,9酶原被激活。经磁热疗后K562/G细胞Hsp70蛋白的表达升高并且随着热疗温度的升高表达增强,而β-catenin蛋白的表达相应降低。免疫荧光检测Bax/Bcl-2的比率随着热疗温度的增加也逐渐增大。2.使用沉淀法反应而成的Fe304,其外形近圆球形,直径大约10nm左右,经信号肽修饰后直径大小和形态均保持良好;MTT法检测其毒性较小,细胞相容性好;Zeta电位有所增加;磁饱和度下降;傅立叶红外光谱仪结果显示耦联后粒子出现了 Fe-O-Fe,Si-O,-CO-NH-收缩震动峰,信号肽成功耦联到了磁流体纳米粒。ICP检测结果表明耦联信号肽后单个细胞中的Fe含量均明显增加。激光共聚焦观察带绿色荧光的Fe304磁性纳米粒在信号肽RM,TM的引导下能够穿过细胞膜并在线粒体部位聚集,而RN-MNPs的靶向性不好。SW480细胞与Fe304磁性纳米粒子在交变磁场下43℃加温30min后,耦联信号肽后的纳米粒子对细胞的热疗效果得到了明显增强,其中PRO-MNPs对细胞的效果最好,细胞的存活率仅为29.54%。实验结论:初步阐明了磁感应热疗技术可以激活细胞的线粒体信号通路,从而导致K562/G细胞发生凋亡。为进一步探究该技术的抑瘤机理打下了良好基础。同时发现信号肽修饰的磁性纳米粒是安全可靠的,在应用于磁感应热疗时,能够显著的提高热疗效率。