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花青素因为其具有抗菌、抗炎、抗过敏、抗氧化和抗肿瘤效果引起了世界各国科学家的广泛关注。由于资源和环保问题,各国开始了用植物细胞培养物生产花青素的研究。多年来的研究表明,生产周期长(约15天)已经成为制约这一成果走向产业化的瓶颈之一。植物基因工程技术的日臻完善与植物肽类生长因子(Phytosulfokine,PSK)及其基因的发现为解决上述难题提供了一条崭新的途径。农杆菌法是最常用的一种植物遗传转化方法,迄今获得的许多双子叶植物的转基因植株都是通过这一转化途径实现的。植物硫肽激素-α(PSK-α)是第一种受到鉴定的植物肽类生长因子,它是一个硫酸酯化的五肽分子,能促进植物培养细胞,特别是低密度培养的植物细胞快速增殖;研究发现拟南芥中有4个PSK基因。
该文首次对农杆菌介导的玫瑰茄遗传转化体系的建立进行了研究,首次根据拟南芥基因组数据库提供的基因序列用PCR的方法克隆分离得到拟南芥AtPSK3基因。主要研究结果如下:
1.农杆菌介导的玫瑰茄遗传转化体系的建立(1)农杆菌介导的玫瑰茄外植体遗传转化体系的建立:采用10~12d的玫瑰茄无菌苗叶片和下胚轴下段作为最佳转化受体;最佳预培养时间为2d;于A600约为0.5的菌液中浸泡10min的侵染效果最好;最佳共培养时间为3d;最适选择压力为50mg/L的卡那霉素(kanamycin,Kan);最佳抑菌剂浓度为300mg/L的头孢霉素(cefotaxine,Cef)。
(2)农杆菌介导的玫瑰茄愈伤组织遗传转化体系的建立:采用中段经过悬浮培养的玫瑰茄愈伤组织作为转化受体,最佳继代培养基为B5+2mg/L2,4-D+0.1mg/LKT;最佳转化时间为继代后8~10d;附加的100μmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)在pH值为5.6时对转化有明显促进作用,A600约为0.5的菌液中浸泡10min的侵染效果最好;最佳共培养时间为3d,初步选择压力为100mg/LKan,随继代次数增多而逐步增加到300mg/L;最佳抑菌剂浓度为300mg/LCef。
2.转基因玫瑰茄的检测与鉴定根据(1)和(2)最佳转化条件获得的抗性玫瑰茄愈伤组织生成率分别为42%和8%,GUS表达率分别为70%和50%,以有GUS活性的抗性愈伤组织组织的总DNA为模板进行PCR扩增,均得到约1.8kb的片断。
3.基因克隆利用PCR方法,根据拟南芥基因组数据库所提供的AtPSK3基因序列设计引物,从拟南芥基因组DNA中克隆了AtPSK3基因。序列分析结果表明,该基因全长530bp,序列与数据库中的核苷酸序列同源性达100%。
农杆菌介导玫瑰茄遗传转化体系的建立和拟南芥AtPSK3基因的克隆为AtPSK3基因导入玫瑰茄细胞,获得快速增殖的细胞系,并在此基础上筛选出花青素高产细胞株奠定基础。