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柑橘全爪螨(Panonychus citri)为世界性柑橘害螨，在中国季节性爆发的现象越来越频繁，主要原因在于果园害螨种群动态监控不得当，缺乏预警机制，加之杀螨剂使用不规范所造成的害螨抗药性问题，使得化学防控效果减弱。柑橘全爪螨已对联苯肼酯、螺螨酯、阿维菌素、噻螨酮等多种化学杀螨剂产生不同程度抗性。由于新型、高效杀螨剂市场更新迭代过慢，目前已经难以满足生产者对害螨有效防控的要求。
双甲脒为一种广谱性杀虫/螨剂，常用于家畜、宠物表皮寄生虫防治，此外，该药剂对蚜虫、木虱、蜱虫，害螨也表现出良好的致死效果，近年来常用于防控柑橘全爪螨，以缓解其他类型杀螨剂由于抗药性造成的防效下降问题。根据杀虫剂抗性执行委员会(Insecticide Resistance Action Committee, IRAC)分类，双甲脒属于章鱼胺受体激动剂，主要作用于章鱼胺受体，刺激害虫不断产生兴奋而死。目前对该药剂抗性机理研究主要集中在寄生蜱虫β-adrenergic章鱼胺受体和OCT/Tyr受体基因突变，单胺氧化酶(MO)及ABC转运蛋白活性的改变等。而叶螨科害螨对双甲脒的抗性分子机制，还未有学者报道。
为了更好地监控和延缓害螨对双甲脒抗药性，在敏感品系的基础上，通过室内长期药剂筛选，获得柑橘全爪螨双甲脒抗性品系，并通过抗性遗传分析、基因组重测序、比较转录组、RNAi以及真核蛋白表达等遗传及分子生物学技术，从代谢及靶标抗性两个方面，探究柑橘全爪螨对双甲脒的抗药性分子机制，为后续柑橘全爪螨抗药性治理提供理论依据。主要研究结果如下：
1.柑橘全爪螨对双甲脒的抗性遗传方式
在室内对柑橘全爪螨进行持续筛选，获得柑橘全爪螨双甲脒抗性品系，LC50值为2361.45mgL-1，抗性倍数达到81.35倍。进一步对柑橘全爪螨敏感品系与抗性品系进行杂交，子代F1SS♀×RS♂的D值为0.11，F1RS♀×SS♂的D值为0.06，两者均介于0-1之间；正、反交F1代剂量-死亡率曲线重合，抗性性状没有受到细胞质遗传物质的影响；对回交后代的剂量-期望反应值进行评估，发现与实际值具有显著差异，以上结果说明柑橘全爪螨双甲脒抗性性状属于常染色体上多基因控制的非完全显性遗传。
2.柑橘全爪螨基因组测序
通过第二代IlluminaHiseq测序平台完成了柑橘全爪螨基因组调研图分析，并通过第三代Nanopore测序平台完成了柑橘全爪螨基因组高质量的组装和注释。柑橘全爪螨基因组组装大小约83.97Mb(GeneBank Accession Number:JAAABK000000000)，包含144条Contigs，ContigN50约为1.81Mb，GC含量31.33%，Gaptotallength为0，由于ContigN50足够大，因此没有进行Scaffold组装。二代测序reads比对率评估、BUSCO完整性评估和CEGMA完整性评估表明，基因组组装质量良好。基因组结构预测获得11,577个基因，平均基因长度3924.13bp，平均外显子长度2003.09bp，平均内含子长度1921.04bp。有10,940个基因在GO、KOG、KEGG、Swissprot、nr等数据库获得功能注释。
3.BSA性状定位
柑橘全爪螨基因组包含5个章鱼胺受体相关基因：EVM0004493.1、EVM0000696.1、EVM0005310.1、EVM0003022.1、EVM0010902.1。系统发育分析显示，上述基因分别与α-adrenergic-like、β-adrenergic-like和章鱼胺/酪胺(OCT/Tyr)三个类型的章鱼胺受体簇集在一块。抗敏基因比对未发现微小扇头蜱中报道的I/F非同义突变，但EVM0010902.1和EVM0004493.1基因mRNA表达量抗性品系显著低于敏感品系。进一步采用BSA(Bulked Segregant Analysis)性状定位探究柑橘全爪螨对双甲脒的靶标突变基因。对亲本和子代4个极端性状样本进行基因组重测序，共获得76.86Gbp数据(SRA Accession Number:PRJNA600137)，平均覆盖深度为205.50倍。敏感亲本和抗性亲本之间存在66,718个SNP位点，子代之间存在68,285个SNPs位点。通过SNP-index和ED两种方法对SNP和性状进行关联分析，亲本和后代共有且与性状相关的SNPs有38个，7个位于contig00002,31个位于contig00033，包括29个NON_SYNONYMOUS_CODING和9个UTR_5_PRIME，其中与性状相关度最高的SNP位于β-2R章鱼胺受体EVM0004493.1基因中，T碱基突变为C碱基，该位点位于基因5’UTR区第752碱基处(T752C)。mRNA二级结构预测发现，碱基突变后，β-2R章鱼胺受体mRNA二级结构上游区域，一条长茎环变为3个短发夹结构。柑橘全爪螨田间种群同样存在T752C突变，且双甲脒抗性倍数与突变频率之间存在相关性，相关系数为94.40%。
4.双甲脒解毒相关基因筛查
增效试验结果表明，抗性品系(RS)经PBO、DEM、DEF处理后，双甲脒对柑橘全爪螨的毒力值分别为711.53mgL-1、1441.51mgL-1、906.39mgL-1，与对照组LC50相比较，增效比SR分别为2.71、1.34、2.13，PBO与DEF对双甲脒的增效作用明显，SR均大于2，增效剂对应的靶标为细胞色素P450和酯酶，表明这两类酶系对双甲脒的代谢解毒具有一定作用。增效剂DEM对应的靶标解毒酶—谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases, GSTs)对双甲脒的代谢解毒作用不明显。在基因组水平对柑橘全爪螨代谢相关基因进行了筛查，发现柑橘全爪螨基因组包含54个P450s、20个GSTs、46条羧酸酯酶家族基因、92个ABC转运蛋白基因、80个主要易化子超家族、16个脂笼蛋白和39个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶。比较转录组分析发现，敏感品系和抗性品系存在748条差异表达基因，其中代谢相关基因有23条，包含P450s、CCEs、ABC转运蛋白，未发现GSTs，与增效试验结果一致。实时荧光定量PCR分析显示，柑橘全爪螨P4504C1(c22254.graph_c0)、ABCG23(c23311.graph_c0)和AchE4(c17984.graph_c0)基因在抗性品系及双甲脒胁迫下，上调表达明显。
5.解毒相关基因功能分析
进一步通过RNAi和真核蛋白表达系统对柑橘全爪螨3个解毒候选基因P4504C1、AchE4和ABCG23进行功能验证。柑橘全爪螨饲喂500ng/μLdsRNA后，与对照组相比，P4504C1、AchE4和ABCG23mRNA相对表达量分别下调了42.90%，33.37%和70.56%。基因沉默后，经过双甲脒处理，抗性品系校正死亡率分别为66.26%，58.78%，67.45%，相比于对照组上升了15.07%，7.59%，16.26%。以上结果表明P4504C1、AchE4和ABCG23基因对双甲脒的代谢解毒具有一定作用。通过草地贪夜蛾Sf21无细胞表达系统对P4504C1和AchE4两种功能蛋白进行表达合成。2个基因完整开放阅读框成功克隆，以pF25K为基础，成功构建重组质粒pF25K::P4504C1和pF25K::AchE4表达载体。SDS-PAGE电泳后，在激光成像仪下，P4504C1蛋白和AchE4蛋白均出现特异性的荧光条带，位置位于53-70KDa之间，说明蛋白质表达成功，为后续双甲脒的体外代谢实验提供了酶源。
双甲脒为一种广谱性杀虫/螨剂，常用于家畜、宠物表皮寄生虫防治，此外，该药剂对蚜虫、木虱、蜱虫，害螨也表现出良好的致死效果，近年来常用于防控柑橘全爪螨，以缓解其他类型杀螨剂由于抗药性造成的防效下降问题。根据杀虫剂抗性执行委员会(Insecticide Resistance Action Committee, IRAC)分类，双甲脒属于章鱼胺受体激动剂，主要作用于章鱼胺受体，刺激害虫不断产生兴奋而死。目前对该药剂抗性机理研究主要集中在寄生蜱虫β-adrenergic章鱼胺受体和OCT/Tyr受体基因突变，单胺氧化酶(MO)及ABC转运蛋白活性的改变等。而叶螨科害螨对双甲脒的抗性分子机制，还未有学者报道。
为了更好地监控和延缓害螨对双甲脒抗药性，在敏感品系的基础上，通过室内长期药剂筛选，获得柑橘全爪螨双甲脒抗性品系，并通过抗性遗传分析、基因组重测序、比较转录组、RNAi以及真核蛋白表达等遗传及分子生物学技术，从代谢及靶标抗性两个方面，探究柑橘全爪螨对双甲脒的抗药性分子机制，为后续柑橘全爪螨抗药性治理提供理论依据。主要研究结果如下：
1.柑橘全爪螨对双甲脒的抗性遗传方式
在室内对柑橘全爪螨进行持续筛选，获得柑橘全爪螨双甲脒抗性品系，LC50值为2361.45mgL-1，抗性倍数达到81.35倍。进一步对柑橘全爪螨敏感品系与抗性品系进行杂交，子代F1SS♀×RS♂的D值为0.11，F1RS♀×SS♂的D值为0.06，两者均介于0-1之间；正、反交F1代剂量-死亡率曲线重合，抗性性状没有受到细胞质遗传物质的影响；对回交后代的剂量-期望反应值进行评估，发现与实际值具有显著差异，以上结果说明柑橘全爪螨双甲脒抗性性状属于常染色体上多基因控制的非完全显性遗传。
2.柑橘全爪螨基因组测序
通过第二代IlluminaHiseq测序平台完成了柑橘全爪螨基因组调研图分析，并通过第三代Nanopore测序平台完成了柑橘全爪螨基因组高质量的组装和注释。柑橘全爪螨基因组组装大小约83.97Mb(GeneBank Accession Number:JAAABK000000000)，包含144条Contigs，ContigN50约为1.81Mb，GC含量31.33%，Gaptotallength为0，由于ContigN50足够大，因此没有进行Scaffold组装。二代测序reads比对率评估、BUSCO完整性评估和CEGMA完整性评估表明，基因组组装质量良好。基因组结构预测获得11,577个基因，平均基因长度3924.13bp，平均外显子长度2003.09bp，平均内含子长度1921.04bp。有10,940个基因在GO、KOG、KEGG、Swissprot、nr等数据库获得功能注释。
3.BSA性状定位
柑橘全爪螨基因组包含5个章鱼胺受体相关基因：EVM0004493.1、EVM0000696.1、EVM0005310.1、EVM0003022.1、EVM0010902.1。系统发育分析显示，上述基因分别与α-adrenergic-like、β-adrenergic-like和章鱼胺/酪胺(OCT/Tyr)三个类型的章鱼胺受体簇集在一块。抗敏基因比对未发现微小扇头蜱中报道的I/F非同义突变，但EVM0010902.1和EVM0004493.1基因mRNA表达量抗性品系显著低于敏感品系。进一步采用BSA(Bulked Segregant Analysis)性状定位探究柑橘全爪螨对双甲脒的靶标突变基因。对亲本和子代4个极端性状样本进行基因组重测序，共获得76.86Gbp数据(SRA Accession Number:PRJNA600137)，平均覆盖深度为205.50倍。敏感亲本和抗性亲本之间存在66,718个SNP位点，子代之间存在68,285个SNPs位点。通过SNP-index和ED两种方法对SNP和性状进行关联分析，亲本和后代共有且与性状相关的SNPs有38个，7个位于contig00002,31个位于contig00033，包括29个NON_SYNONYMOUS_CODING和9个UTR_5_PRIME，其中与性状相关度最高的SNP位于β-2R章鱼胺受体EVM0004493.1基因中，T碱基突变为C碱基，该位点位于基因5’UTR区第752碱基处(T752C)。mRNA二级结构预测发现，碱基突变后，β-2R章鱼胺受体mRNA二级结构上游区域，一条长茎环变为3个短发夹结构。柑橘全爪螨田间种群同样存在T752C突变，且双甲脒抗性倍数与突变频率之间存在相关性，相关系数为94.40%。
4.双甲脒解毒相关基因筛查
增效试验结果表明，抗性品系(RS)经PBO、DEM、DEF处理后，双甲脒对柑橘全爪螨的毒力值分别为711.53mgL-1、1441.51mgL-1、906.39mgL-1，与对照组LC50相比较，增效比SR分别为2.71、1.34、2.13，PBO与DEF对双甲脒的增效作用明显，SR均大于2，增效剂对应的靶标为细胞色素P450和酯酶，表明这两类酶系对双甲脒的代谢解毒具有一定作用。增效剂DEM对应的靶标解毒酶—谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases, GSTs)对双甲脒的代谢解毒作用不明显。在基因组水平对柑橘全爪螨代谢相关基因进行了筛查，发现柑橘全爪螨基因组包含54个P450s、20个GSTs、46条羧酸酯酶家族基因、92个ABC转运蛋白基因、80个主要易化子超家族、16个脂笼蛋白和39个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶。比较转录组分析发现，敏感品系和抗性品系存在748条差异表达基因，其中代谢相关基因有23条，包含P450s、CCEs、ABC转运蛋白，未发现GSTs，与增效试验结果一致。实时荧光定量PCR分析显示，柑橘全爪螨P4504C1(c22254.graph_c0)、ABCG23(c23311.graph_c0)和AchE4(c17984.graph_c0)基因在抗性品系及双甲脒胁迫下，上调表达明显。
5.解毒相关基因功能分析
进一步通过RNAi和真核蛋白表达系统对柑橘全爪螨3个解毒候选基因P4504C1、AchE4和ABCG23进行功能验证。柑橘全爪螨饲喂500ng/μLdsRNA后，与对照组相比，P4504C1、AchE4和ABCG23mRNA相对表达量分别下调了42.90%，33.37%和70.56%。基因沉默后，经过双甲脒处理，抗性品系校正死亡率分别为66.26%，58.78%，67.45%，相比于对照组上升了15.07%，7.59%，16.26%。以上结果表明P4504C1、AchE4和ABCG23基因对双甲脒的代谢解毒具有一定作用。通过草地贪夜蛾Sf21无细胞表达系统对P4504C1和AchE4两种功能蛋白进行表达合成。2个基因完整开放阅读框成功克隆，以pF25K为基础，成功构建重组质粒pF25K::P4504C1和pF25K::AchE4表达载体。SDS-PAGE电泳后，在激光成像仪下，P4504C1蛋白和AchE4蛋白均出现特异性的荧光条带，位置位于53-70KDa之间，说明蛋白质表达成功，为后续双甲脒的体外代谢实验提供了酶源。