发光和磁性纳米晶的表面修饰及其在临床检测中的应用

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肿瘤标记物就是肿瘤细胞产生和释放的某种物质,常以抗原、酶、激素等代谢产物的形式存在于肿瘤细胞内或宿主体液中,根据其生化或免疫特性可以识别或诊断肿瘤。血清中肿瘤标志物的含量可以作为诊断癌症的重要标准,而检测肿瘤标志物浓度的常用方法不但耗时费力,而且需要经过训练的专业人员进行操作,还需要先进的仪器设备。因此,开发一种快速而廉价的检测方法,对预防癌症并及时采取治疗措施尤为必要。半导体量子点(QDs)CdTe具有的诸多优点(高强荧光发射、谱峰窄、峰形对称、稳定性好,不易被光分解和漂白等)使它比传统的染料(异硫氰酸荧光黄、罗丹明等)具有更明显的优势,更适合于生物医学领域的应用。同时,磁性纳米粒子由于其本身特性在生物医学领域的应用也得到推广。本课题将应用这两种纳米粒子各自的优势,开发一种能快速和准确检测肿瘤标记物的新型试剂盒,研究步骤如下:首先,制备荧光性能好的CdTe QDs,并对其制备过程进行优化。CdTe的制备采用巯基水相法,即利用巯基乙酸(TGA)作为稳定剂,在水相中进行合成。同时对CdTe QDs的制备过程中具有至关重要作用的因素做出系统研究,这些因素包括反应时间、反应前驱体中环境pH值,前驱体摩尔比和放置时间,并通过对这一系列反应条件的改变,获得制备CdTe量子点的最佳条件;第二,将制备出的CdTe QDs与BSA共价结合。观察结合前后荧光强度的变化,用凝胶电泳证明它们的相互结合,同时对反应体系pH、反应时间和交联剂的用量进行优化,结果显示,CdTe QDs可以作为一种很好的蛋白质探针,用于标记抗体;第三,制备出顺磁性良好的Fe3O4纳米粒子,并用溶胶-凝胶法制备Fe3O4/SiO2核壳结构的纳米粒子,并对这种粒子的分散性和晶型做出表征,然后用硅烷偶联剂(GMPS)对其进行修饰,使其表面含环氧乙醚基基团;第四,将该复合磁性纳米粒子与羊抗鼠抗体(IgG)混合搅拌过夜,这样环氧乙醚基就能够比较容易和蛋白质的氨基相互作用生成共价键,最终实现Fe3O4纳米粒子和IgG分子的共价结合,并利用红外光谱仪观察结合反应前后表面基团的变化。使用考马斯亮蓝法(bradford)检测Fe3O4/SiO2-GPMS-IgG复合磁性纳米粒子所携带的IgG的量。结果发现,1mg的磁性纳米粒子表面包含的IgG的量约为8.11μg,这说明复合磁性纳米粒子表面携带足够的IgG,这为下一步三明治复合的制备打下基础;最后,将两种纳米复合物应用到检测中,这就需要绘制标准工作曲线、推算标准工作方程,然后将临床血液样品的检测数据代入方程就能计算出相应抗原的含量,其步骤为:(1)将制备好的Fe3O4/SiO2纳米粒子用GMPS修饰,然后和鼠抗人抗体(记为第一抗体)进行结合,得到“Fe3O4—第一抗体”复合物。使用这种复合物与一系列已知标准浓度的抗原结合,通过磁分离对抗原进行分离纯化,得到“磁性纳米粒子—第一抗体—抗原”复合物。(2)制备水溶性荧光纳米粒子,并将其与另外一种鼠抗体(区别于第一抗体,与第一抗体识别抗原的位点不一样,记为第二抗体)结合,得到“CdTe-第二抗体”复合物。(3)将“CdTe-第二抗体”复合物和“Fe3O4—第一抗体—抗原”复合物作用,得到三明治复合物。结合磁分离,洗去未结合的“CdTe-第二抗体”复合物,然后将产物定容至1ml并测荧光,得到荧光强度和抗原浓度的对应关系,分别绘制出甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的“荧光强度—抗原浓度”工作曲线,并根据该工作曲线,算出标准工作方程分别为:y=1.30(X-8.30)和M=0.68(N-0.50)。(4)使用同样的方法分别处理10例临床血液样品。实验结果发现,本实验所得到的检测结果和使用Elisa检测所得到的结果较为相似,但仍然有偏差,出现这种结果可能的原因是由于磁性纳米粒子发生团聚吸附了少量的量子点,也可能是因为抗原的特异性不强,还可能是血样受到本体干扰。由于条件限制,本课题不能随意采集到人体血样,期望在后续的研究中,能够在采血过程中注意血液的前处理,减少处理不当带来的本体干扰。同时,纳米粒子的制备过程有待进一步优化,以制备出半坡峰更窄的CdTe量子点和单分散性更好的磁性纳米粒子等。
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