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Mortalin作为热休克蛋白70家族成员之一,参与多种细胞进程在,并在多种肿瘤中表达升高。目前肝内胆管癌中Mortalin具体作用不清,本实验通过临床组织、体外细胞株和裸鼠实验三个部分,阐述在肝内胆管癌肿瘤组织中Mortalin的表达及临床意义、其对肝内胆管癌细胞侵袭迁移、上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)以及 PI3K/Akt/mTOR 信号通路的影响。第一部分:肝内胆管癌中Mortalin的表达及其临床意义[目的]明确在肝内胆管癌肿瘤组织中Mortalin多种水平的表达情况,探讨Mortalin表达与肝内胆管癌临床病理学特征之间的关联和意义,了解Mortalin表达状况在肝内胆管癌病人预后中的作用。[方法]利用实时荧光定量法和Western blot法检测10例配对的肝内胆管癌肿瘤组织和正常肝脏组织中mRNA水平和蛋白水平表达;采用免疫组织化学法检测2套组织芯片和临床组织切片中Mortalin蛋白表达,结合临床病理资料分析Mortalin与肝内胆管癌临床病理特征之间的相互关系;根据随访数据,进行生存预后分析明确Mortalin表达情况对肝内胆管癌病人中预后的影响,随后综合分析Mortalin联合其他临床病理特征因素对肝内胆管癌病人生存预后中的意义。[结果]实时荧光定量和Western blot法检测结果表明无论是mRNA水平还是蛋白水平,Mortalin在肿瘤组织中表达均明显高于正常肝脏组织;免疫组化检测肝内胆管癌肿瘤组织、正常肝脏组织和肝内正常胆管组织结果表明,在肿瘤组织中Mortalin表达显著高于正常肝脏组织和肝内正常胆管组织;临床病理特征分析结果表明,肿瘤组织高表达的Mortalin与肝内胆管癌TNM分期、肿瘤低分化和淋巴结转移密切相关;生存曲线分析结果表明Mortalin高表达的病例总体生存率更低,在联合临床病理特征进行生存曲线分析结果表明Mortalin高表达与淋巴结转移和高TNM分期病例总体生存率更差;Cox多变量回归分析结果表明Mortalin可独立于其他危险因素作为肝内胆管癌患者总体生存预后因素之一。[结论]高表达的Mortalin与肝内胆管癌侵袭、转移以及预后不良密切相关。第二部分:Mortalin表达与肝内胆管癌细胞上皮间质转化的关系[目的]探讨Mortalin对体外肝内胆管癌细胞侵袭转移的作用,研究Mortalin 与上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)之间的相关性。[方法]通过Western blot法检测不同肝内胆管癌细胞株中Mortalin的表达情况;过表达Mortalin慢病毒载体转染细胞株HCCC9810,慢病毒介导的短发卡RNA-Mortalin转染细胞株QBC939干扰Mortalin表达。Transwell检测肝内胆管癌细胞株的侵袭和迁移能力,细胞划痕检测细胞迁移能力,Western blot检测细胞中EMT相关蛋白的变化情况;利用组织芯片,检测EMT相关蛋白snail,联合Mortalin染色进行生存曲线绘制分析。将不同处理Mortalin后的细胞株注射到裸鼠体内,观察Mortalin干扰和过表达后在动物体内成瘤的情况,测定裸鼠体内肿瘤中相关蛋白。[结果]过表达HCCC9810细胞中的Mortalin后,细胞侵袭和迁移能力明显增强;EMT相关蛋白检测结果表明,HCCC9810细胞上调Mortalin表达后,E-cadheirn表达显著受到抑制,间质表型vimentin和N-cadheirn明显上调,EMT重要转录因子snail和slug同样明显上调;QBC939细胞Mortalin干扰下调后间质表型N-cadherin,EMT重要转录因子slug也明显下调;裸鼠体内实验结果显示,HCCC9810细胞过表达Mortalin表达后裸鼠体内成瘤体积和重量明显增加,QBC939细胞干扰Mortalin表达后裸鼠体内成瘤体积和重量显著受到抑制;测定裸鼠体内瘤体蛋白结果显示,在Mortalin表达上调瘤体组织中N-cadherin上调,E-cadheim下调,在Mortalin下调瘤体组织中N-cadherin下调,E-cadheim上调;在临床病理组织切片EMT转录因子snail检测联合Mortalin分析总体生存情况显示,当Mortalin和snail同时高表达的病例总体生存率更差。[结论]高水平的Mortalin可促进肝内胆管癌细胞侵袭及迁移能力,诱导肝内胆管癌EMT。第三部分:Mortalin激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肝内胆管癌细胞迁移及侵袭能力和诱导EMT[目的]探讨Mortalin与PI3K/AKT/mTOR信号通路的关系,及其对肝内胆管癌细胞EMT的影响。[方法]Western blot检测慢病毒处理前后HCCC9810和QBC939细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路变化,PI3K抑制剂LY294002处理过表达Mortalin细胞株HCCC9810-Mortalin抑制PI3K活性,检测处理前后各组细胞间细胞侵袭、迁移、PI3K/AKT/mTOR信号通路和EMT相关蛋白。[结果]过表达HCCC9810细胞中的Mortalin后,细胞信号通路PI3K/AKT/mTOR 蛋白 p-p85、p-Akt 和 p-mTOR 磷酸化水平显著升高,QBC939细胞干扰Mortalin表达后p-p85、p-Akt和p-mTOR磷酸化水平显著抑制;采用LY294002处理过表达Mortalin细胞株HCCC9810-Mortalin后,细胞侵袭和迁移能力与HCCC9810-Mortalin组相比显著降低,而与HCCC9810-nc组之间无明显差异;Western blot检测蛋白结果表明,采用LY294002处理过表达Mortalin细胞株 HCCC9810-Mortalin 后,较 HCCC9810-Mortalin 组细胞相比 p-Akt、p-mTOR、slug、vimentin 和 N-cadheirn 均显著降低,E-cadherin 明显增加,与 HCCC9810-nc组相比 p-Akt、p-mTOR、slug、vimentin、N-cadheirn 和 E-cadherin 无明显差异。[结论]Mortalin通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肝内胆管癌细胞EMT