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目的镁黄长石在皮肤组织工程的应用是个全新的方向,目前少数报道可见其在创面修复领域中能起到抗炎、促进内皮细胞增殖和分化的作用,但创面愈合是一个复杂而精密的过程,尤其是在再上皮化及重塑阶段,镁黄长石促进创面愈合的作用机制尚未阐明。本试验旨在观察镁黄长石对表皮干细胞和成纤维细胞增殖、迁移的作用,深入探究生物活性陶瓷—镁黄长石提供的多种阳离子启动与创面愈合相关的信号通路,为镁黄长石在组织工程学的应用上提供一个新方向和实验依据。方法1.选用人表皮干细胞(Human epidermal stem cells,hESCs)系进行体外试验。使用生物活性陶瓷—镁黄长石(Akermanite,Aker)制成浸提液,稀释成为不同浓度,将hESCs放置于中,用CCK-8法筛选出培养hESCs最适宜的浸提液浓度,进一步用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)及流式细胞术(Flow CytoMetry,FCM)定量检测三个细胞亚群(G0/G1、S和G2/M)的分布来判定细胞增殖情况;然后用RT-q-PCR法及western blot法检测出hESCs“干性”相关分子Itgβ1、lgr4、lgr5和lgr6等的基因表达,进一步探究浸提液刺激hESCs干性及增殖能力变化的可能机制。另外,通过S cratch法观察浸提液对hESCs的移行能力的影响,采用RT-q-PCR法及western blot法探究与迁移相关的整合素亚基的基因及蛋白的表达。2.提取及培养人成纤维细胞(Human Fibroblasts)进行体外试验。使用镁黄长石制成浸提液,用CCK-8法筛选出培养hESCs的最佳浓度,进一步用FCM法测Aker对成纤维细胞增殖能力的作用;然后采用RT-q-PCR法及western blot法,测出成纤维细胞在Aker处理后,合成出的新的Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因、蛋白之表达;另外,通过Scratch法观察Aker对成纤维细胞迁移能力的作用,采用RT-q-PCR法及western blot法探究与迁移能力相关的整合素亚基的基因及蛋白的表达。3.建立BALB/c小鼠烫伤模型,给予Aker粉剂治疗和不治疗处理。观察两组的创面愈合情况。用造模后3、7、14和21天皮肤创面组织,通过HE、IF和Masson染色方法,观察和统计再上皮化、表皮厚度、hESCs干性及胶原沉积的情况。结果1.Aker浸提液对hESCs增殖起到了促进诱导作用,并在不同稀释比例的溶液中其作用表现强弱不同。结果示1/16浓度,其提升细胞活力的作用最为显著。1/16浓度浸提液培养的 hESCs,RT-q-PCR 及 western blot 定量检测,其 Itgβ1、lgr4、lgr5 和 lgr6的mRNA表达上调,Itgβ1蛋白也有提高,提示浸提液增加了 hESCs的干性,致使它的增殖能力变强。同时RT-q-PCR及western blot定量测出Wnt/β-catenin信号通路上有代表性的β-catenin、c-myc、ccnd1的mRNA和蛋白表达都有上调,显示该信号通路被Aker含的活性阳离子激活。另外,划痕法显示1/16浓度组相较于阴性对照组hESCs的迁移能力大大的提高,RT-q-PCR及western blot定量检测结果提示浸提液促进了细胞内的整合素α5β1、α3β1和α6β4上调。2.Aker浸提液也促进诱导成纤维细胞增殖,并在不同稀释比例的溶液中的作用表现强弱不同。此时1/64浓度,其在提高细胞活力和增殖能力最为显著。1/64浓度浸提液处理的成纤维细胞,用RT-q-PCR、western blot定量分析,显示其Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA及蛋白表达均有提高。另外,划痕实验结果显示1/64浓度组相较于阴性对照,成纤维细胞迁移能力增强,RT-q-PCR及western blot定量检测结果提示Aker促进此种细胞的整合素α5β1和α3β1上调。3.小鼠烫伤模型实验,证实Aker粉剂带来促皮肤愈合的效应。HE染色结果显示,Aker粉剂组的再上皮化进程加速,上皮厚度在愈合中期明显厚于对照组,提示Aker粉剂可以有效加强表皮细胞的增殖与分化。IF染色结果显示,在皮肤切片整合素β1表达上,Aker粉剂组要强于对照组,提示该种活性陶瓷可提高表皮细胞的干性。同时,Masson染色的皮肤切片显示,经Aker处理的创面,胶原沉积面积相较要大,排列要整齐,提示镁黄长石对诱导成纤维细胞分泌合成胶原,修复效果要好。结论本研究对生物活性陶瓷--镁黄长石促进皮肤创面愈合的机制进行了初步探索,发现Aker浸提液里包含的钙镁硅三种阳离子能够激活Wnt/β-catenin信号通路,提高表皮细胞的干性,起到促进表皮细胞及成纤维细胞的增殖及迁移的作用,从而加速的再上皮化和胶原的沉积,实现缩短创面愈合时间,扩展了生物活性陶瓷在组织工程领域的应用范围,为创面愈合临床治疗提供新的思路、方向和理论依据。