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[目的]间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）在皮肤创面愈合过程中起着积极的作用,大量的研究表明,这种促进作用可能是通过其来源的外泌体来发挥的。外泌体可用于无细胞治疗,与MSCs相比,更便于储存和运输,同时也避免了细胞移植带来的肿瘤等风险。本研究通过分离、提取和培养人脐带间充质干细胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs）,收集hUC-MSCs的培养上清,提取外泌体,通过体外实验探究外泌体促进皮肤创面愈合的机制以及对人真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblasts,HDFs）的作用和影响,争取突破hUC-MSCs治疗创面的伦理、运输、肿瘤发生等方面的瓶颈,为后续将MSCs用于创面愈合的临床治疗作理论准备。[方法]1.hUC-MSCs的提取、培养和鉴定:组织块贴壁法提取hUC-MSCs,显微镜镜下观察细胞的形态结构。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90、CD105、CD34、CD45表达情况。定向诱导hUC-MSCs的成脂成骨分化,分别用油红O和茜素红染色法鉴定其多向分化潜能。2.hUC-MSCs来源的外泌体的分离、提取和鉴定:通过试剂盒法提取外泌体。透射电镜观察外泌体,粒径分析检测外泌体的粒径大小,Western Blot鉴定外泌体标志物CD9和CD63的表达。3.hUC-MSCs来源的外泌体对HDFs的作用及影响:分别将0、25、50、75、1 00μg/mL的外泌体作用于HDFs,通过CCK-8检测第1、2、3、4、5天的HDFs增殖情况;探究外泌体促进HDFs增殖的最佳浓度。通过qRT-PCR检测经过外泌体处理后的HDFs的人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白（Phosphatase and Tensin Homolog Deleted on Chromosome Ten,PTEN）和发芽 RTK 信号拮抗剂 1（Sprouty RTK Signaling Antagonist 1,SPRY 1）的表达情况,并与对照组作比较。分别使用miR-21-5p mimic和inhibitor处理hUC-MSCs,再分离hUC-MSCs的培养基里的外泌体,分别将这两组外泌体作用于HDFs;siPTEN和siSPRY1分别作用于HDFs;未经过处理的hUC-MSCs的培养上清中提取的外泌体作用于HDFs;对照组不加外泌体。用CCK-8试剂盒检测并比较以上六组对HDFs的影响。用外泌体处理HDFs;对照组不做任何处理;用miR-21-5p inhibitor预处理的hUC-MSCs来源的外泌体处理HDFs。ELISA检测以上三组的HDFs中的磷酸化AKT和磷酸化ERK1/2蛋白的量。[结果]1.hUC-MSCs鉴定的结果:镜下观察,细胞呈长梭形,生长状态良好。流式细胞术的结果示,所提取的细胞低表达CD34、CD45,高表达CD90、CD105。hUC-MSCs经成骨和染色后,观察到红色的钙结节。hUC-MSCs经成脂和染色后,可观察到红色的脂滴。因此,提取的细胞具有hUC-MSCs的特征,可用于后续实验。2.hUC-MSCs来源的外泌体的分离、提取和鉴定:透射电镜结果示,观察外泌体呈圆盘状小泡,膜的边界清晰。粒径分析结果示:所得PBS悬液中的颗粒peak analysis表明峰值是（126.53±2.41）nm,大部分外泌体的直径在40-200nm范围之间。Western Blot结果表明,外泌体可表达CD9和CD63蛋白。以上结果均说明,通过试剂盒分离和提取得到的PBS悬液中含有大量外泌体。3.hUC-MSCs来源的外泌体对HDFs的作用及影响:qRT-PCR的检测结果示,经过外泌体处理后的HDFs的PTEN和SPRY1的表达均较对照组低（P＜0.05）。CCK-8的检测结果示,外泌体处理组在第2d（P＜0.05）、3d（P＜0.001）、4d（P＜0.001）、5d（P＜0.001）均高于对照组。这一结果进一步验证了外泌体对 HDFs 的增殖作用。siPTEN 组在第 2d（P＜0.05）、3d（P＜0.05）、4d（P＜0.001）、5d（P＜0.05）均高于对照组。提示PTEN的敲低可以实现类似外泌体促进HDFs增殖的效果。siSPRY1组在第2至第5d（P＜0.05）也高于对照组。提示SPRY1的敲低也可以实现类似外泌体促进HDFs增殖的效果。MiR-21-5p mimic组在第2d（P＜0.05）、3d（P＜0.001）、4d（P＜0.001）、5d（P＜0.001）均高于对照组,提示经过miR-21-5p mimic处理后的hUC-MSCs的外泌体可以促进HDFs增殖,且从整体趋势上看,miR-21-5p mimic组促进HDFs增殖的作用是所有分组中最强的。外泌体处理组在第 2d（P＜0.05）、3d（P＜0.05）、4d（P＜0.001）、5d（P＜0.05）,均高于 miR-21-5p inhibitor 组。提示经过 miR-21-5p inhibitor 处理后的hUC-MSCs的外泌体促进HDFs增殖的作用有所减弱,即miR-21-5p inhibitor可逆转或是抑制外泌体促进HDFs的增殖作用。siPTEN组在第2d（P＜0.05）、4d（P＜0.001）、5d（P＜0.05）均高于 miR-21-5p inhibitor 组,siSPRY1 组在第 4d（P＜0.05）高于miR-21-5p inhibitor组。结合这些结果来看,外泌体促进HDFs的增殖作用,可能与miR-21-5p和PTEN、SPRY1均有密切的关联。ELISA检测磷酸化AKT和磷酸化ERK1/2蛋白的检测结果示,外泌体处理组的磷酸化AKT和磷酸化ERK1/2蛋白的表达均高于对照组（P＜0.05）说明了外泌体可以激活PI3K/AKT和ERK1/2的信号通路。miR-21-5p inhibitor组的磷酸化AKT和磷酸化ERK1/2蛋白的表达与对照组比较（P＞0.05）,可认为两组间无差别;但是在与外泌体处理组的比较中,发现外泌体处理组的磷酸化AKT蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白的表达明显高于miR-21-5pinhibitor组（P＜0.05）。这与CCK-8的实验结果保持一致,再一次验证了 miR-21-5p inhibitor可逆转或是抑制外泌体对HDFs的作用。提示了 hUC-MSCs来源的外泌体可能通过调节miR-21-5p,抑制PTEN和SPRY1的表达,激活PI3K/AKT和ERK1/2信号通路。[结论]1.经过细胞形态学、细胞表面标志物、成骨成脂分化诱导并鉴定后,可以认为提取所得的细胞是hUC-MSCs。2.经过外泌体的透射电镜、粒径大小分析、Western Blot检测表面标志物后,可以认为提取所得的PBS悬液中富集有外泌体。3.hUC-MSCs来源的外泌体可以促进HDFs的增殖,且在0、25、50、75、100μg/mL的5个外泌体浓度中,以100μg/mL的外泌体作用最好;而其促进成纤维细胞增殖的作用可能是通过介导miR-21-5p,下调PTEN和SPRY1,激活PI3K/AKT和ERK1/2信号通路来实现的。