论文部分内容阅读
蛋白质组学以其高通量等优势为我们探寻基因功能的奥秘提供了一种新的思路和研究手段。蛋白质组研究在特定事件或环境下某个细胞或某种组织的基因组表达的全部蛋白质，旨在列出全部蛋白质的细目，弄清楚每一个蛋白质的结构和功能及蛋白质群体内的相互作用，对比疾病和健康状态下它们的表达水平的变化。每一种生命运动形式都是特定蛋白质群体在不同时间和空间出现并发挥功能的结果，因而蛋白质组研究是我们理解细胞功能和疾病发生、发展过程的中心环节。
双向凝胶电泳技术自其诞生起已被广泛的应用于分析细胞、组织、体液中蛋白质的组成，以及分离蛋白质复合物，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用和代谢过程。其原理是第一向基于蛋白质等电点的不同，用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同，用SDS-PAGE分离，把复杂的蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。随着技术的日新月异，双向电泳技术已成为蛋白质组学研究的主要支撑技术之一，在寻找肿瘤标志物方面具有重要意义。
由于胰腺位置隐蔽，胰腺癌临床症状不典型，同时又缺少敏感和特异性的诊断指标，导致胰腺疾病胰腺癌的早期诊断极为困难，已严重威胁人类的健康和生命。因此，发现新的敏感和特异性的胰腺癌标记物进行早期肿瘤的筛查，发现新的有效的治疗性分子靶点，成为当前胰腺癌研究的主要方向。
本文从三个方面分别探讨了双向凝胶电泳技术平台的建立，以及双向电泳在胰腺癌研究中的初步应用等问题。
第一部分：双向凝胶电泳技术体系的建立
目的：建立起适用于细胞、组织、体液、血清等多种样品的双向凝胶电泳技术平台，并进行部分拓展实验。
方法：通过对多种样品的预处理实验、双向电泳和后续分析鉴定的流程进行了优化，建立了一套较为标准化的基于双向电泳的蛋白质组实验方案。对常规双向电泳技术进行了拓展，尝试了一种多根IPG胶条在一块凝胶上进行SDS-PAGE方法。并对差异凝胶电泳的条件进行了初步摸索。
结果：建立起适用于细胞、组织、体液、血清等多种样品的双向凝胶电泳技术体系。能够有效去除大多数电泳干扰物质，提高蛋白的抽提率，并可以有效的提高电泳的分辨率和重现性。
结论：通过对双向电泳各步骤的实验探讨和优化，建立起适合于分析细胞、组织、体液、血清等多种样品的双向电泳流程，为进一步开展基于双向电泳的蛋白质组学研究奠定了基础。
第二部分：利用双向电泳技术构建人正常胰液蛋白表达谱
目的：建立并优化人胰液蛋白质组的双向凝胶电泳分离方法。
方法：通过比较几种常用的体液处理方法，确定了一种适于人胰液的蛋白样品处理方法。经过一维等电聚焦和二维SDS-PAGE电泳后，有效分离了人胰液蛋白质组。
结果：通过优化胰液蛋白质提取、上样量和固相IPG胶条分离范围的选择等步骤，建立了人胰液双向凝胶电泳的方法，并获得了分辨率较高、重复性较好的双向凝胶电泳图谱。
结论：丙酮沉淀与双向凝胶电泳技术的结合是研究人胰液蛋白质组的一种有效的方法。胰液双向凝胶电泳方法的优化可为今后开展疾病相关的胰液蛋白质组学研究提供技术基础。
第三部分：利用双向凝胶电泳技术发现胰腺癌与正常胰腺组织的差异表达蛋白。
目的：分析并发现胰腺癌与正常胰腺组织的差异表达蛋白。
方法：结合双向凝胶电泳和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)等蛋白质组学相关技术研究了八对胰腺导管癌(PDAC)及相应正常胰腺组织样品。
结果：获得了分辨率较高、重复性较好的双向凝胶电泳图谱；发现了48种差异表达蛋白质——其中36种蛋白质在PDAC明显表达上调，12种蛋白质在PDAC中明显表达下调。其中18种蛋白已经被报道过，其余的30种蛋白均是首次被发现在胰腺导管癌中差异表达。
结论：初步鉴定得到了48个差异表达蛋白质，其中有30种蛋白质首次在胰腺导管癌中被发现，将有望从其中发现有意义的生物标志物，用于胰腺导管癌的早期诊断和药物靶点研究。