DIP1-DST转录调控通路调控水稻抗旱耐盐的机制研究

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在水稻中,通过多年的研究,目前已经有一部分抗旱、耐盐相关基因包括一些转录因子被克隆,而且通过基因工程技术应用于植物抗逆育种中。其中包括发现的锌指转录因子新基因DST,其是水稻抗旱耐盐的负向调控因子,dst突变体会明显提高水稻抗旱耐盐性,在育种中有广泛应用前景。  本论文的工作进一步研究了DST的抗逆机制。通过酵母双杂交和芯片技术找到了一些参与DST抗逆机制的新成员。通过酵母双杂交,发现了一个与DST相互作用的锌指蛋白DST Interaction Protein1(DIP1),并利用体内双分子荧光技术和体外Pull-down实验进一步验证二者的相互作用。由于DIP1是一个功能未知的CHY锌指蛋白,为了研究这个基因的功能,首先在水稻中用35S驱动子过量表达了DIP1,另外,在突变体库中订购了该基因的突变体dip1。35S∷DIP1使转基因植株对盐、旱胁迫变得更敏感,与气孔开度增加有关;而dip1对盐、旱胁迫耐受性增强,与气孔开度减少有关;同时35S∷ DST与35S∷DIP1类似,也使转基因植株对盐、旱胁迫变得更敏感。随后我们研究了DIP1在各个组织中的表达模式以及皿细胞定位,发现其与DST非常类似。通过芯片发现,并采用ChIP和EMSA验证的DST下游基因peroxidase24 precursor(Prx24),其参与清除H2O2,在dst和dip1中表达量下调,在DST过量表达和DIP1过量表达植株中表达量上调。并且,在WT(ZH11)和dst突变体中过量表达Prx24都会使植物抗逆能力降低。综合DIP1过量表达植株、DST过量表达植株和dip1突变体在盐、旱逆境下的表型以及DIP1对DST下游基因的影响,我们推测DIP1可能对DST转录活性有促进作用。  利用双荧光报告系统在拟南芥原生质体里检测DIP1对转录因子DST转录激活活性的影响,结果显示DIP1对DST的转录活性确实有促进作用。另外凝胶滞后实验的结果显示,DIP1不能单独与DST BindingSequence(DBS,DST结合的顺式元件)结合,需要与DST一起结合DBS。此外,还发现了用DST自身启动子驱动DST基因不能完全互补dst突变体在正常培养以及在盐、旱逆境下的表型,因此推测DST可能是通过形成二聚体或寡聚体的形式行使功能。通过双分子荧光技术和pull-down实验验证了猜测,并发现DIP1并不能与自身发生相互作用。综合上述的实验结果,推测DIP1与DST可以形成一个异源四聚体结合到含有DBS的H2O2代谢基因上,如Prx24,并通过调节这些基因的表达来影响气孔中H2O2含量,进而调控气孔开度,最终影响植物的抗旱耐盐能力。
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