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松针褐斑病是发生在我国南方松树上的一种严重病害,致病菌为松针褐斑病菌(Lecanostictaacicola)。该病菌的次生代谢产物中含有能伤害非寄主杂草的活性物质,尤其对恶性杂草紫茎泽兰(EupatoriumadenophorumSpreng.)有明显伤害作用。本研究在前人研究的基础上,以紫茎泽兰为生测对象,采用生测为导向,提取、分离、纯化松针褐斑病产生的杀草活性物质。波谱分析方法确定杀草活性物质的化学结构。初步研究了杀草毒素的除草活性及对紫茎泽兰的伤害机理,为今后深入的研究和开发奠定基础。主要研究结果如下:
用PD、黄豆粉、玉米粉、改良的Fries、紫茎泽兰叶汁、紫茎泽兰叶汁+PD、紫茎泽兰叶汁+Fries七种不同培养液培养松针褐斑病菌,比较不同培养液对病原菌生长和产毒的影响。结果显示:病菌在纯紫茎泽兰叶汁中的生长较差,产毒较少,在PD和改良的Fries培养液中生长良好。紫茎泽兰叶汁对病菌在PD、改良的Fries培养液中的生长和产毒能力都无明显影响。无水乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、氯仿:甲醇(95:5、90:10、80:20、70:30、1:1)十种不同有机溶剂及组合对松针褐斑病菌PD培养液代谢产物进行提取。结果显示:杀草活性物质是一种极性较大的小分子物质,相比之下,氯仿:甲醇(1:1)的混合溶剂提取效果较好,能把活性物质从代谢物中较充分提取出来,且所含杂质较少。
比较了针刺法、浸渍法、涂抹法三种不同生测方法的生测效果及紫茎泽兰不同部位对毒素的敏感性,研究了毒素不同浓度对叶片的伤害。结果显示:针刺法是一种较好的方法,效果明显,反应速度快且毒素用量少。紫茎泽兰叶片对毒素最敏感,根对毒素只有轻微的反应。毒素粗提液稀释l倍,对紫茎泽兰叶片仍然有明显的伤害作用。
采用柱层析和高效液相色谱分离相结合,以紫茎泽兰作为生测对象,从松针褐斑病菌的PD培养产物中分离纯化出一种杀草活性物质,记为M。该物质为无色油状物。紫外扫描显示M的最大吸收波长为207nm。在365mn和254nm波长下吸收极弱。FAB-MS和HRFABMS显示该物质的相对分子质量为162,分子式为C6H1005。1HNMR谱中的2个信号(6L26,64.22)表明该物质存在一OCH(CH3)基团。13CNMR谱显示有3个碳信号(6181.00,666.99,62L69),证明存在一COOH,一CH,一CH3基团。综合质谱、核磁共振谱分析确定M的结构为COOHCH(CH3)OCH(CH3)COOH(α,α一二异丙酸醚)。IR谱显示2812cm-I处有一个较宽的一COOH峰:1128cm"处有一个中等强度吸收峰,显示有>C—O—C<存在,也证实了毒素的这一化学结构。证明该菌产生的杀草活性物质与致病毒素是一致的。
以紫茎泽兰叶片及其愈伤组织为材料,研究了杀草毒素对紫茎泽兰叶组织及其愈伤组织的细胞膜透性、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)的活性以及丙二醛(MDA)含量的影响。结果显示,杀草毒素使紫茎泽兰叶片及其愈伤组织细胞膜透性上升,MDA含量上升:毒素对紫茎泽兰叶片和愈伤组织POD、PPO有明显的抑制作用,POD、PPO活性较对照显著降低。CAT活性呈先升后降的趋势,在6h达到最高。