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研究背景增生性瘢痕(hypertrophic scar)及瘢痕疙瘩(keloid)是伤口愈合过程调节异常导致的一类纤维化疾病,以成纤维细胞过度增殖,表皮间质转化,肌成纤维细胞增多,细胞外基质(ECM)过度沉积为主要特征。二者组织学方面差异不明显,临床表现则各异,增生性瘢痕常常局限于受伤部位,高出皮肤表面,偶有疼痛、瘙痒等不适,发展时限常超过1年,但存在一定的自限性,随着时间的延长可逐渐萎缩;而瘢痕疙瘩则常常超出病变边缘,具有侵袭性,明显高出皮肤表面,有疼痛、痉痒的症状出现,发展时限可长达数年,不能随着时间的延长而自行改善。且由于此类疾病的病理生理机制复杂,临床上一直缺乏有效的治疗手段。近年来,干细胞被广泛应用到临床治疗中,大量的研究表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以促进组织的高质量愈合。而脂肪来源的间充质干细胞(ADSCs)相较于其它种类的间充质干细胞具有来源广泛,供区损伤小,组织相容性好的优点。但目前关于脂肪来源间充质干细胞对增生性瘢痕以及瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞的生物学行为影响以及相关作用机制的研究尚未完善。现有研究表明,TGF-β1的激活是引起皮肤纤维化的经典驱动力,其中TGF-β1/Smad通路是纤维化疾病的经典通路,抑制这一信号通路可以有效的阻断纤维化的进程。而Notch信号通路被发现在肾纤维化、肺纤维化以及肝纤维化中与TGF-β1协同作用,促进了纤维化的进展,且Notch信号也被发现在皮肤瘢痕组织,尤其是瘢痕疙瘩中高表达。故本项研究选取不同时间点的ADSCs细胞培养基制作ADSCs条件培养基,并用其处理增生性瘢痕成纤维细胞(HSFs)以及瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs),以正常皮肤的成纤维细胞(NFs)为对照,观察ADSCs条件培养基对增生性瘢痕成纤维细胞以及瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和纤维化表型等生物学行为的影响,及其对TGF-β1/Smad和Notch信号通路的作用。研究方法1.获取吸脂术中人的脂肪组织标本,以消化法分离培养人ADSCs,取P3代hADSCs 扩增培养 12h,24h,48h,获得 12hhADSCs 条件培养基(12h-CM),24h hADSCs 条件培养基(24h-CM),48h hADSCs 条件培养基(48h-CM),以无 ADSCs的无血清低糖DMEM于培养箱内孵育Oh、12h、24h、48h分别获得空白对照组培养基(NC)以及 12h、24h、48h 条件对照组培养基(12h-CC、24h-CC、48h-CC);2.获取人正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩标本,部分制备成厚度为4μm组织切片以行免疫组织化学染色;同时其余标本以贴壁法分离培养NFs、HSFs和KFs,分别传至P3代备用;3.分别以空白对照组培养基、条件对照组培养基以及12h-CM,24h-CM,48h-CM处理培养NFs、HSFs和KFs 24h,以CCK-8法检测细胞增殖曲线、细胞划痕实验检测迁移能力、MUSE试剂盒检测细胞凋亡、细胞周期、LDH试剂盒检测细胞毒性;4.分别以空白对照组培养基、条件对照组培养基以及12h-CM,24h-CM,48h-CM处理培养处理培养NFs、HSFs和KFs 24h,行real-time PCR检测纤维化相关的基因mRNA的表达;5.分别以空白对照组培养基、条件对照组培养基以及12h-CM,24h-CM,48h-CM处理培养NFs、HSFs和KFs 24h,以real-time PCR检测不同实验组细胞外基质成分—I型胶原、纤维连接蛋白在mRNA水平的表达。且检测细胞培养上清中羟脯氨酸的含量来检测成纤维细胞的细胞外基质合成分泌情况。6.细胞免疫荧光染色检测NFs、HSFs和KFs的α-SMA、Notch1和TGF-β1表达情况;7.分别以空白对照组培养基、条件对照组培养基以及12h-CM,24h-CM,48h-CM处理培养 NFs、HSFs 和 KFs 24 小时,以 real-time PCR检测 Notch1,Jagged-1(JAG-1,Notch ligand),Jagged-2(JAG-2),Delta-1,TGF-β1,SMAD2,SMAD3 的 mRNA 表达情况,western blot检测其蛋白表达情况。研究结果1.从人脂肪组织中提取的细胞高表达间充质干细胞表面标记物,且能够向脂肪组织以及骨组织分化;2.人ADSCs条件培养基体外环境下处理KFs以及HSFs并不诱导细胞凋亡,且不导致细胞乳酸脱氢酶漏出增多;3.人ADSCs条件培养基抑制HSFs和KFs的增殖和迁移,G0/G1期细胞比例升高,其中48 h组条件培养基作用明显;4.人ADSCs条件培养基抑制HSFs和KFs的纤维化表型相关基因的表达;5.人ADSCs条件培养基抑制HSFs和KFs合成细胞外基质,表现为抑制Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的表达,同时抑制羟脯氨酸的合成;6.免疫组化以及免疫荧光染色发现α-SMA在瘢痕疙瘩以及增生性瘢痕存在组织及细胞水平的高表达,且经过人ADSCs条件培养基处理后,HSFs和KFs的α-SMA在基因和蛋白水平的表达降低;7.免疫组织化学以及细胞免疫荧光检测发现瘢痕疙瘩及增生性瘢痕存在TGF-β1、Notch1组织以及细胞水平的高表达;人ADSCs条件培养基处理HSFs和KFs后,KFs出现Notch1/JAG-1以及TGF-β1/SMAD3 mRNA、蛋白表达明显降低,HSFs出现TGF-β1/SMAD3 mRNA、蛋白表达明显降低。结论1.本研究从脂肪组织提取的细胞经鉴定为人ADSCs(hADSCs);2.人ADSCs条件培养对体外培养的HSFs和KFs无细胞毒性且不诱导细胞凋亡;3.人ADSCs条件培养基抑制HSFs和KFs的增殖、迁移,且细胞周期阻滞于G0/G14.人ADSCs条件培养基抑制HSFs和KFs纤维化表型;5.人ADSCs条件培养基抑制HSFs和KFs的细胞外基质成分的合成;6.人ADSCs条件培养基处理HSFs和KFs后,肌成纤维细胞转化减少;7.人ADSCs条件培养基对KFs纤维化表型的抑制作用可能与Notch1/JAG-1以及TGF-β1/SMAD3信号通路下调相关,而对HSFs纤维化表型的抑制作用可能与下调TGF-β1/SMAD3信号通路相关。