论文部分内容阅读
淀粉占小麦籽粒容重的65%-80%,是粒重的决定因素。小麦籽粒中淀粉的合成是通过一系列酶促反应来完成的。AGPase是淀粉合成过程中的限速酶,在植物中,AGPase存在四种形式的亚基:胞质型小亚基(SSUⅠ)、质体型小亚基(SSUⅡ)、胞质型大亚基(LSUⅠ)和质体型大亚基(LSU Ⅱ)。本研究选用粒重不同的两个小麦品种,研究分析了它们的籽粒淀粉积累速率与AGPase的酶活性差异,并采用半定量PCR法,比较两个小麦品种籽粒内上述4个亚基表达量的差异,发现LSUⅠ亚基在籽粒淀粉合成中可能起重要作用;并克隆了LSUⅠ基因的开放编码域序列(Open reading frame,ORF),构建了该基因的过表达载体,通过花粉管通道法,将其导入到小麦中,并通过PCR检测、southern杂交和荧光实时定量PCR测定,获得了LSUⅠ过表达的转基因小麦植株,发现转基因植株籽粒内淀粉含量显著提高。主要的试验结果如下:1.选用粒重不同的两个小麦品种豫教2号和兰考矮早八,对二者籽粒灌浆期的淀粉积累速率、AGPase活性及其4个亚基的转录水平进行了测定。结果发现,在小麦籽粒灌浆的前10天,两品种间的淀粉积累速率与AGPase活性没有差别;但在籽粒灌浆的中后期,豫教2号籽粒的淀粉积累速率及AGPase活性显著高于兰考矮早八。在籽粒灌浆期和成熟期,豫教2号籽粒中的LSUⅠ基因表达量显著高于兰考矮早八,而两品种间其它3个亚基的转录水平在整个籽粒灌浆期间无明显差异;同时发现LSUⅠ基因的表达量与AGPase活性和淀粉积累速率的变化趋势基本一致,而其它3个亚基基因的表达量与AGPase活性及淀粉积累速率的变化不尽相同,由此推测LSUⅠ基因对AGPase活性和淀粉积累起重要作用。2.为验证上述推测,本研究克隆出LSUⅠ基因的ORF序列,其总长为1947 bp(GenBank登录号为:DQ839506),构建了LSUⅠ基因的过表达载体,并利用花粉管通道法将此载体导入到小麦中,经PCR及Southern杂交鉴定获得了转基因植株;采用荧光定量PCR分析发现LSUⅠ基因在转基因小麦植株的籽粒内表达量显著升高,表明转基因小麦植株内LSUⅠ基因得到了过表达。生理生化测定结果发现,部分转基因小麦籽粒内AGPase活性、淀粉含量和粒重均显著增加,进而证明了LSUⅠ在小麦籽粒淀粉合成中重要作用的推测。