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研究背景与目的:间质性肺病(ILD)是一组慢性、渐进性、弥漫性、致命性的肺部纤维化疾病。其病因不明，发病机制尚未完全明确，目前缺乏有效的治疗方法。特发性肺纤维化(IPF)是间质性肺病的主要常见类型。其病理变化以肺泡上皮细胞损伤、大量成纤维细胞增生和细胞外基质聚集增多为特点。目前大部分的药物都无法有效地逆转肺损伤，肺移植成为治疗晚期疾病的唯一有效的方法。上皮-间质转化（EMT)是上皮细胞经历向间质细胞形态转变的一个过程。在生理状态下，EM T在多细胞生物胚胎发育时起到很重要的作用。然而，在成人阶段，EM T涉及到病理的状态如肿瘤的转移和器官的纤维化。EMT是纤维化局部成纤维细胞的重要来源，肺泡上皮细胞可以在各种损伤因子的刺激下转变为肌成纤维细胞。EMT的发生发展与多种信号通路及细胞因子有关，Notch则是最近发现的与其关系比较密切的信号通路。Notch信号通路是一条高度保守的信号通路，它能调节细胞间的交流和影响细胞周期。研究表明Notch信号通路在纤维化疾病中被激活，而阻断 Notch信号通路可以抑制 EMT，减少肺内肌成纤维细胞的生成，减缓或逆转肺组织纤维化的进展。天龙咳喘灵胶囊作为广州医科大学附属第一医院的院内制剂，已投入使用三十余年，具有调平肾中阴阳，健脾理气降逆等功效，在临床上长期用于治疗喘息型慢性支气管炎、慢阻肺、哮喘、肺癌术后等疾病，疗效确切且无明显毒副反应。 本实验室前期研究发现天龙咳喘灵复方水煎液通过降低细胞内磷酸化 ERK1/2的水平来下调气道上皮下成纤维细胞的a-SMA表达，从而干预上皮下成纤维细胞向肌纤维母细胞转分化的过程。这提示了天龙咳喘灵用于治疗肺纤维化的可能性。本次实验将验证天龙咳喘灵提取物是否能成功逆转由转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的A549细胞的EMT，并探索其机制是否是通过调节Notch信号通路来达到抑制此作用。 研究内容和方法： 第一部分天龙咳喘灵提取物抑制TGF-β1诱导的A549细胞EM T过程 1.体外培养A549细胞，用TGF-β1诱导A549细胞发生EMT，同时加入不同浓度的天龙咳喘灵提取物刺激48h后，相差倒置显微镜下观察A549细胞形态学改变。 2. qRT-PCR法检测E-cadherin和Fibronectin水平的表达变化。 3.Western blotting法检测E-cadherin和Fibronectin蛋白水平的表达变化。 第二部分天龙咳喘灵提取物通过调节Notch信号通路抑制TGF-β1诱导EMT 1.用Western blotting方法检测不同时间点TGF-β组和TGF-β+天龙组的A549细胞TGF-β1信号通路中P-Smad2和S mad2蛋白水平的表达变化。 2.用qRT-PCR和Western blotting方法检测不同时间点TGF-β组和TGF-β+天龙组的A549细胞Notch信号通路受体Notch1、Notch2，配体Jagged1和靶基因Hey1基因和蛋白的表达情况。 3.观察转染Jagged1 siRNA敲除靶基因后，对TGF-β1诱导的EMT的影响，RT-PCR检测Hey1 mRNA表达变化，western blotting检测E-cadherin、Fibronectin蛋白表达的影响。 结果： 第一部分天龙咳喘灵提取物抑制TGF-β1诱导的A549细胞EM T过程 1.在相差倒置显微镜下观察A549细胞形态学改变，可见与对照组A549细胞比较，经TGF-β15ng/ml刺激48h后，大部分细胞呈现出梭形细长的间质细胞形态，意味着细胞发生EMT转变，而在同时添加不同浓度的天龙咳喘灵提取物后，上述形态改变呈不同程度的逆转，细胞恢复卵圆形的上皮细胞形态。 2.qRT-PCR、Western blotting结果显示，与对照组相比，经TGF-β1刺激后，上皮标志E-cadherin的mRNA和蛋白表达下调，间质标志Fibronectin mRNA和蛋白表达的上调，而加入不同天龙咳喘灵提取物时可以不同程度抑制这种改变。 第二部分天龙咳喘灵提取物通过调节Notch信号通路抑制TGF-β1诱导EMT 1.Western blotting结果显示，加入TGF-β1刺激后，在各个时间点p-Smad2的表达量均上调，而加入天龙咳喘灵提取物干预后，p-Smad2表达量下调。 2.qRT-PCR和Western blotting结果显示，加入TGF-β1刺激后，Notch2、Jagged1、Hey1的表达量随着时间上调，而Notch1表达量无明显变化；而在TGF-β1与天龙共同刺激组，Notch1、Notch2、Jagged1、Hey1的表达量均随着时间下调。 3.转染Jagged1 siRNA成功敲除Jagged1基因后，靶基因Hey1表达降低，说明Notch信号通路被抑制，与TGF-β1组相比，TGF-β1+Jagged1siRNA组上皮标志E-cadherin蛋白表达量增高，间质标志Fibronectin蛋白表达量降低，TGF-β1诱导的EMT受到抑制。 结论： 1.天龙咳喘灵提取物能抑制由TGF-β1诱导的A549细胞的EM T。 2.天龙咳喘灵提取物能抑制TGF-β/S mad信号通路。 3. TGF-β1通过激活Notch信号通路促进EMT，而天龙咳喘灵提取物能抑制Notch信号通路的激活，抑制Notch信号通路能逆转TGF-β1诱导的EMT转变。