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目的观察白附片对正常大鼠和肾阳虚证大鼠的毒性反应差异,探索基于中医证候动物模型评价中药毒性的科学、合理性。方法建立肾阳虚证大鼠模型,从生化、免疫、病理、代谢组学等方面评价白附片对正常大鼠和肾阳虚证大鼠的毒性反应并比较两者差异。1.动物SPF级雄性SD大鼠80只,体重200±20g。2.分组、造模及给药80只大鼠随机分为正常组和模型组。模型组连续9d肌注氢化可的松琥珀酸钠溶液35.715 mg/kg·d,制作肾阳虚证模型。造模结束后将两组大鼠分别随机分为低剂量、小剂量、中剂量和大剂量4个给药组和空白对照组,每组8只;给药浓度从低到高依次为:0.32 g/kg·d、0.64 g/kg·d、1.28g/kg·d和2.56 g/kg·d,连续给药14d。3.取血和取材给药结束后麻醉取血,制备血清、血浆;取脏器(心、肝、肾、肾上腺、脾);称取脏器湿重、计算脏器系数,4%的甲醛溶液固定组织,以及制备心肌组织匀浆。4.常规实验研究4.1观察指标观察大鼠行为形态及体重的变化。以Biopac MP多道生理记录仪描记Ⅱ导联心电图,记录心率(BPM)和峰-峰值(p-p),以及心律失常情况。全血检测:白细胞总数(WBC)、红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)和血小板总数(PLT)。血清生化检测:总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)、血糖(GLU)、总胆红素(T-BIL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、尿酸(UAC)、天门冬氨酸转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)。放射性免疫检测:促肾上腺皮质激素(ACTH),皮质醇(COR),环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)。免疫比浊检测:心肌琥珀酸脱氢酶(SDH)和心肌钠-钾ATP酶(Na~+-k~+-ATPase)。HE染色,光镜观察心、肝、肾、肾上腺和脾脏的病理改变情况。4.2统计分析计量资料采用单因素方差分析,广义线性模型两因素方差分析、协方差分析、球形检验、重复测量方差分析,以及直线回归分析;计数资料用Logistic回归分析。显著性水平取P<0.05。5.代谢组学研究采用液相色谱-质谱联用的代谢组学技术获取代谢物指纹图谱数据;用正交偏最小二乘法对数据进行挖掘。结果1.常规实验研究结果1.1大鼠行为形态及体重变化情况随着给药剂量的增大,正常大鼠的行为形态毒性表现比模型大鼠突出;在低剂量给药时,模型大鼠肾阳虚表现明显缓解,白附片发挥治疗效应。正常和模型大鼠体重均随天数增长,剂量越大增长的幅度越小,提示白附片的毒性与剂量相关,剂量越大则毒性越大;在低剂量给药时,模型大鼠体重随天数增长的幅度较正常大鼠大,白附片发挥治疗效应。1.2主要血常规指标变化情况氢化可的松造模导致WBC和PLT降低。给白附片后,正常大鼠WBC和PLT随剂量增加而降低,表现为白附片的毒性效应;而模型大鼠WBC和PLT随剂量增加而升高,表现为白附片的治疗效应。氢化可的松造模可导致RBC和HGB的降低,尤其以HGB降低更为明显。白附片对正常大鼠的RBC和HGB有一定的影响,主要表现为随着剂量的增加RBC和HGB有轻微降低的趋势。对模型大鼠,低剂量白附片能提高血液RBC和HGB的水平。1.3血清糖、脂、蛋白指标变化情况氢化可的松造模导致GLU降低。给白附片后,正常大鼠GLU随剂量增加而降低,表现为白附片对正常大鼠的毒性效应;而模型大鼠GLU随剂量增加而升高并趋于正常,表现为白附片提高正常大鼠GLU的治疗效应。氢化可的松造模导致TG的升高,而给白附片后,模型大鼠TG有降低的趋势。给予白附片能使正常大鼠和模型大鼠CHO和TP有升高的趋势。1.4反映心脏功能的指标变化情况白附片可使正常大鼠和模型大鼠心律失常。随着剂量的增加,心律失常发生率升高。白附片引起模型大鼠心律失常的发生率低于同剂量白附片引起正常大鼠心律失常的发生率,提示白附片对正常大鼠的心律影响更大。白附片可加快正常大鼠和模型大鼠的心率,随着剂量的增加心率加快,但模型大鼠心率加快的幅度较小。白附片引起正常大鼠和模型大鼠P-P增大,增幅一致。随着白附片剂量的增大,正常大鼠和模型大鼠的心脏系数和LDH有增大的趋势。正常大鼠LDH升高的更快,反映了白附片对正常大鼠周围心肌酶的异常影响。随着白附片剂量的增加,正常大鼠和模型大鼠的SDH和Na~+-K~+-ATP酶有下降的趋势,正常大鼠SDH下降的更快,提示白附片也对正常大鼠和模型大鼠的心肌组织线粒体标志酶有不同的影响。1.5反映肝肾功能的指标变化情况随着白附片剂量的增加,正常大鼠和模型大鼠的ALT有升高的趋势,正常大鼠升高的更快,提示白附片对正常大鼠的肝毒性更突出。随着白附片剂量的增加,正常大鼠BUN有升高的趋势,反映了白附片可能对正常大鼠有一定的肾毒性。1.6反映神经、内分泌功能的指标变化情况氢化可的松造模导致cAMP和COR降低而cGMP升高。随着白附片剂量增加,模型大鼠cAMP/cGMP和COR有升高的趋势。随着白附片剂量的增加,正常大鼠和模型大鼠的肾上腺系数有增大的趋势,而胸腺系数有减小的趋势。1.7病理组织形态学变化情况白附片可引起正常大鼠和模型大鼠心、肝、肾、肾上腺和脾脏的组织形态学改变,其改变程度随着剂量的增加而加重。同一剂量给药时,两种大鼠同一脏器的病理改变存在差异,模型大鼠病理改变相对较轻。2.代谢组学研究结果氢化可的松造模导致溶血磷脂酰乙醇胺(18:0LPE)和溶血磷脂酰胆碱(20:5LPC)下调。18:0LPE和20:5LPC是正常大鼠和模型大鼠给予白附片后两者血浆代谢不同变化的主要标志物。正常大鼠18:0LPE和20:5LPC随剂量的增加有下降的趋势,而模型大鼠变化不明显。结论本研究发现:白附片可导致正常大鼠和肾阳虚大鼠行为形态,体重,血细胞,糖、脂、蛋白代谢,心、肝、肾功能,神经、内分泌功能,组织形态学,以及血浆代谢物的异常。这些异常反映了白附片对正常大鼠和肾阳虚大鼠的毒性作用。两者异常的差异表现为所涉及的指标不同,并且同一指标的异常程度有差异,具体可见白附片导致肾阳虚大鼠的异常指标相对较少,异常程度较轻。而且,从某些指标来看,白附片对肾阳虚大鼠有明显的治疗作用。本研究为基于中医证候动物模型评价中药毒性的合理性提供了客观依据,是丰富和完善现代药物毒性评价理论和方法体系的有益探索。