论文部分内容阅读
目的: 1.构建不同配制方案的hUMSCs/Collagen typeⅠ复合体，并向类软骨细胞诱导分化。 2.通过正交实验探索hUMSCs/Collagen typeⅠ复合体的最佳配制方案。 方法: 通过流式细胞技术及定向诱导方法鉴定hUMSCs；参考预实验结果及相关文献，确定hUMSCs接种密度与Collagen typeⅠ浓度的实验水平；设计正交实验表，将不同密度的hUMSCs与不同浓度的Collagen typeⅠ制备成不同组合方案的hUMSCs/Collagen typeⅠ复合体后，予以软骨细胞诱导液及常规孵育条件下培养，分别于第1、2、3周在光学显微镜下观察复合体中细胞形态，利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖数量，通过免疫组化方法观察其蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白的分泌分布，最后通过ELISA方法检测其蛋白多糖的定量分泌情况，以完成复合体的体外构建及最佳制备方案的探索。统计学方法：所有资料经SPSS16.0软件建立数据库进行统计分析，采用正交实验方差分析法。 结果: 1. hUMSCs/Collagen typeⅠ复合体中的细胞均匀分布于三维空间中正常贴壁生长，并被诱导为类软骨细胞，分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原，尤以复合体边缘细胞明显。 2.2.5mg/ml Collagen typeⅠ制备的复合体既具有合理的胶凝时间（3-5分钟）又具有一定的力学强度可维持立体塑形形态。 3.对指标Ⅰ（细胞增殖数量）的影响因素为：A-hUMSCs接种密度＞B-Collagen typeⅠ浓度＞C-时间，A为显著影响因素（P＜0.05）；A(7.5)B(1.5)组合细胞增殖数量最少，A(7.5)B(2.5)次之，A(67.5)B(3.5)最多；细胞增殖数量随时间推移有下降趋势。 4.对指标Ⅱ（GAG含量）的影响因素为：A×B-交互作用＞A-hUMSCs接种密度＞B-Collagen typeⅠ浓度＞C-时间，均为显著影响因素（P＜0.05）；A(7.5)B(1.5)组合GAG含量最多，A(7.5)B(2.5)次之，A(22.5)B(3.5)最少；GAG含量随时间推移有下降趋势。 5.对指标Ⅲ（细胞分泌活力）的影响因素为：A-hUMSCs接种密度＞B-Collagen typeⅠ浓度＞A×B-交互作用＞C-时间，均为显著影响因素（P＜0.05）；A(7.5)B(1.5)组合细胞分泌活力最好，A(7.5)B(2.5)次之，A(67.5)B(3.5)最差；细胞分泌活力随时间推移有先降后升趋势。 结论: 1. hUMSCs/Collagen typeⅠ复合体中的hUMSCs正常生长分化，分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白，具有类软骨细胞功能特性。 2.单纯从细胞功能角度考虑，（7.5×105/ml）hUMSCs/（1.5mg/ml）Collagen typeⅠ组合方案的复合体具有GAG含量高，细胞分泌活力好及节省细胞的优势，为最优组合方案。 3.综合可操作性及力学性能等方面考虑，（7.5×105/ml）hUMSCs/（2.5mg/ml） Collagen typeⅠ组合方案为最佳制备方案。