【摘 要】
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鸭病毒性肠炎(duck viral enteritis, DVE),又名鸭瘟(duck plague, DP),是鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,曾相继在多个国家和地区流行,给养鸭业造成
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鸭病毒性肠炎(duck viral enteritis, DVE),又名鸭瘟(duck plague, DP),是鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,曾相继在多个国家和地区流行,给养鸭业造成巨大的经济损失。本病病原为鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV),亦称鸭疱疹病毒1型(Anatid herpesvirus1),在2011年第九次病毒分类报告(ICTV)中,将其划分为疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科马立克病毒属。根据本实验室克隆DEV C-KCE株US区序列和UL44序列设计引物,扩增同源臂基因,将同源臂基因克隆至pEASY-blunt simple载体,然后将右臂基因通过双酶切连接到左臂下游,构建pEASY-US10和pEASY-UL44载体。将实验室保存的gpt基因连接入pMD18-T simple载体获得pMD18-T-gpt,并插入pEASY-US10和pEASY-UL44两同源臂之间构建了缺失病毒转移载体pEASY-US10-gpt、 pEASY-UL44-gpt,经酶切鉴定结果均为阳性。将转移载体与DEV的DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),待出现病变后,利用霉酚酸(MPA)加压,从而完成重组病毒的筛选、富集和纯化,经过8代筛选纯化获得的重组病毒经PCR. IFA鉴定正确,命名为DEV-△US10、DEV-△UL44。分别提取第1、5、10、15、20代重组病毒基因组,扩增左臂跨臂引物鉴定基因皆得到阳性结果,证明缺失重组病毒稳定存在。将DEV和DEV-△US10以及DEV-△UL44分别接种于CEF细胞(100TCID50/孔),在不同时间分别收集接毒后细胞上清、接毒后细胞和上清以及接毒后用胰酶消化的细胞,测定病毒滴度,绘制病毒生长曲线,结果表明US10基因没有直接参与病毒的内化和释放过程,但UL44基因的缺失影响了DEV的侵入与释放。经细胞传代,重组病毒DEV-△US10/DEV-△UL44均可稳定的在CEF细胞上进行复制,而蚀斑直径的大小也与亲本病毒差异并不显著证明DEV的US10和UL44基因为其复制非必需,可作为外源基因的插入位点构建载体疫苗。
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