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兔球虫病是由艾美尔科的多种球虫所引起的一种原虫性疾病,在我国很多地区感染十分普遍,以1～3月龄的幼兔感染率最高,可达100%,死亡率在70%左右,临床上以腹泻、生长缓慢、消瘦为主要特征,给养兔业带来了严重的危害。病原学调查发现,斯氏艾美尔球虫(E.stiedae)能引起严重的肝球虫病,是兔球虫中致病力最强、危害最大的一种球虫。目前,控制兔球虫病主要采用的是化学药物方法,但随着化学药物残留问题日益突出和耐药虫株的不断出现,使得越来越多的学者希望寻求免疫学方法进行疫苗防控。同时,国内外一些学者用分离的多种兔球虫虫株研制的兔球虫强毒活虫苗,通过免疫试验表明这种球虫活虫苗可诱导机体产生一定的免疫力,但这种强毒活虫苗的接种会引起病原的大量扩散,并且由于兔球虫种类繁多,若按常规方法研制广谱的多价兔球虫疫苗也十分困难。随着分子生物学技术的发展,核酸疫苗日益成为寄生虫病防治的新途径。核酸疫苗具备操作方法简便,能同时诱导机体产生高水平保护性的体液和细胞免疫力,且安全、持效,有抗各种病原体感染及抗肿瘤的广阔应用前景等优点,因此,开发有效的分子佐剂、DNA运输载体等,来提高兔球虫核酸疫苗的免疫效果,并增强其安全性具有重要意义。本试验对E.stiedae孢子化卵囊抗原候选基因MIC-5基因进行了克隆与表达,并对兔IL-6基因进行了克隆、序列分析,构建了Es MIC-5基因与兔IL-6基因的融合基因,并将该融合基因亚克隆到原核表达载体PGEX-KG与真核表达载体pCDNA3.1(-)中,构建出PGEX-MIC-5-IL-6原核表达质粒和pCDNA3.1(-)-MIC-5-IL-6真核表达质粒,最后将真核表达质粒免疫小鼠,以观察兔IL-6基因对Es MIC-5基因核酸疫苗的免疫增强作用。1重组质粒pCDNA3.1(-)-Es MIC-5的构建通过饱和食盐水漂浮法提纯E.stiedae,并培养卵囊至孢子化。将保存的E.stiedae孢子化卵囊,加适量次氯酸钠溶液处理,收集卵囊沉淀,将提纯的E.stiedae吸入到用DEPC处理过的灭菌组织匀浆器内研磨30min,至使80%以上的孢子化卵囊被研破,后按Trizol试剂说明书方法提取其总RNA,经RT-PCR扩增出一条约1100bp的片段,将此基因片段插入同样酶切位点的原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体pCDNA3.1(-)中,经酶切鉴定、PCR扩增鉴定,表明Es MIC-5基因已连接到原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体pCDNA3.1(-)中。并将原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,于37℃IPTG诱导培养获得表达,SDS-PAGE分析显示,表达的Es MIC-5蛋白的分子量约为56Ku。2.兔IL-6基因的克隆与序列分析根据已公布的的欧洲兔IL-6基因序列设计特异性引物,以兔脾脏中的总RNA为模板应用两步法RT-PCR扩增兔IL-6基因,并经酶切鉴定及序列测序,该兔IL-6基因的开放阅读框为726bp。与同类欧洲兔、中国白兔IL-6基因的同源性为100%,与不同物种的水牛、野猪、鸡、norway大鼠、小鼠、黄牛、猪、马的IL-6基因序列的同源性分别为:60.4%、64.3%、42.7%、54.3%、53.9%、61.2%、64.5%、65.4%,表明不同物种之间IL-6基因存在一定的种属差异性。3 MIC-5-IL-6融合基因重组质粒的构建根据已报道的兔斯氏艾美尔球虫微线蛋白5(Es MIC-5)的核苷酸序列和兔白介素6基因序列另设计特异性引物,且在Es MIC-5基因引物上游引入EcoRⅠ位点、下游引入SalⅠ位点。以EsMIC-5的总RNA为模板RT-PCR扩增MIC-5基因,并将其克隆到pMD18-T中。再扩增上游带有SalⅠ位点、下游带有HindⅢ位点的兔IL-6,同时将Es MIC-5插入到含有兔IL-6基因的质粒pMD18-T-IL-6’中,使两个基因首尾相连,且Es MIC-5基因不含终止密码子,兔IL-6基因不含起始密码子。最后将融合基因片段定向克隆到原核表达载体pGEX-KG利真核表达载体pCDNA3.1(-)上,构建成pGEX-MIC-5-IL-6重组质粒和pCDNA3.1(-)-MIC-5-IL-6重组质粒。通过双酶切鉴定,证明融合基因已克隆于原核表达和真核表达载体中。并将原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,于37℃IPTG诱导培养获得表达。SDS-PAGE分析显示,表达的PGEX-MIC-5-IL-6融合蛋白分子量约为85Ku。将试验小鼠随机分成4组,每组8只,分别为:pCDNA3.1(-)-MIC-5-IL-6核酸疫苗组(Ⅰ组)、pCDNA3.1(-)-MIC-5核酸免疫组(Ⅱ组)、空载体pCDNA3.1(-)组(Ⅲ组)、空白对照组(Ⅳ组)。每组肌肉注射小白鼠100ug/只,间隔15d,进行三次免疫。Ⅳ空白对照组按相同程序注射灭菌生理盐水。在首免与二免后15天,分别进行尾静脉采血;第3次免疫一周后进行眼眶采血,分离血清,通过ELISA检测免疫小鼠外周血IL-2、INF-γ结果为:一免和二免,pCDNA3.1(-)-MIC-5-IL-6核酸疫苗免疫组(Ⅰ组)IL-2、IFN-γ水平显著(P＜0.05)高于pCDNA3.1(-)-MIC-5核酸疫苗免疫组(Ⅱ组);三免,pCDNA3.1(-)-MIC-5-IL-6核酸疫苗免疫组(Ⅰ组)IL-2、IFN-γ水平及显著(P＜0.01)高于pCDNA3.1(-)-MIC-5核酸疫苗免疫组(Ⅱ组)。