论文部分内容阅读
线粒体是细胞内一种参与生物能生成与物质代谢的细胞器，它与许多疾病的发生发展有着十分密切的关系。线粒体的研究往往取决于所分离的线粒体数量和质量。差速离心与密度梯度离心方法是传统的线粒体分离技术，但是，这种技术无法有效地应用于小规模线粒体制备。为了从少量细胞中提取高纯度的线粒体，我们提出一种免疫磁珠的方法，通过将特异性针对线粒体外膜蛋白的抗体耦连到磁珠上，然后用以制备有限生物材料中所含的线粒体。本研究中，我们首先表达并纯化了线粒体外膜上的Cytochrome b5 type B(CYB5B)蛋白的膜外部分，然后免疫新西兰兔制备得到多克隆抗体。通过将表达的重组蛋白共价结合到Sepharose4B，然后亲和纯化抗血清，我们得到了高特异性和高滴度的CYB5B抗体。我们将纯化后的CYB5B抗体与Dynal ProteinA磁珠相连，然后将其加入到匀浆后的BGC823细胞裂解液中。通过MgCl2溶液洗脱下线粒体，Westem Blot结果表明得到的线粒体不含有胞浆成分的污染，提取过线粒体的细胞裂解液中不含有线粒体，电镜结果表明线粒体具有较高的纯度和完整性。对于BGC823和HuH7细胞，与传统的差速离心法相比，免疫磁珠法对线粒体的富集效果是其4.89和3.42倍，通过浓度测定，我们从1×107的BGC823和HuH7细胞中分别提取得到41微克和46微克的线粒体蛋白。总之对于少量样品，免疫磁珠法是一种高效的线粒体纯化方法。