【摘 要】
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目的:3,3’-二吲哚甲烷（3,3’-diindolylmethane,DIM）是十字花科蔬菜中的一种生物活性物质吲哚-3-甲醇（I3C）在胃内酸性环境下的水解产物,具有抗肝癌的效应,但其确切的机制尚不清楚。本研究以SMMC-7721和HepG2肝癌细胞株为研究对象探索DIM抑制增殖和诱导凋亡的分子机制及信号通路,为DIM的临床应用提供科学依据。方法:1.采用CCK-8法与克隆形成实验检测肝癌细胞
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目的:3,3’-二吲哚甲烷（3,3’-diindolylmethane,DIM）是十字花科蔬菜中的一种生物活性物质吲哚-3-甲醇（I3C）在胃内酸性环境下的水解产物,具有抗肝癌的效应,但其确切的机制尚不清楚。本研究以SMMC-7721和HepG2肝癌细胞株为研究对象探索DIM抑制增殖和诱导凋亡的分子机制及信号通路,为DIM的临床应用提供科学依据。方法:1.采用CCK-8法与克隆形成实验检测肝癌细胞增殖水平,Hoechst染色、流式细胞术检测细胞凋亡水平,蛋白免疫印迹法检测PCNA和凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、cleaved-PARP、BAX、总p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）和磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）的表达水平。2.以Fluo-3/AM为探针,观察肝癌细胞内胞浆游离钙(cytolic free calcium,[Ca2+]i),检测Ca2+相关蛋白CaMK、calpain、CaSR的表达水平及CaMK的mRNA水平。3.采用钙离子供体（A23187）,内质网钙泵抑制剂（TG、BHQ）增加[Ca2+]i水平,采用胞质钙螯合剂（BAPTA/AM）络合细胞内游离钙离子,PLC-IP3R通路抑制剂（2-APB、U73122）抑制内质网钙库的钙释放来降低[Ca2+]i水平,探索调控钙离子水平在DIM抗肝癌效应中的作用。运用EGTA螯合胞外游离钙,探索钙内流对DIM诱导效应的影响。4.运用钙通道阻滞剂米贝地尔（mibefradil）预处理肝癌细胞0.5h,观察其对DIM的抗肝癌细胞效应的影响。结果:1.与对照组相比,DIM显著降低肝癌细胞的增殖活力,有统计学意义（P<0.05）。DIM抑制肝癌细胞集落形成（P<0.05）及PCNA蛋白水平（P<0.05）。此外,DIM处理组中的细胞核固缩,形状不规则,DIM增加cleaved-caspase3、cleaved-PARP、Bax的水平（P<0.05）。2.DIM增强p-p38 MAPK而总p38 MAPK水平保持不变,与单独DIM处理相比,p-p38抑制剂预处理细胞能够减弱DIM诱导的细胞生长抑制,恢复PCNA的蛋白水平（P<0.05）。p-p38抑制剂预处理还逆转由DIM诱导的细胞凋亡（P<0.05）。3.荧光观察DIM处理组[Ca2+]i升高,CaMK和calpain的表达升高（P<0.05）,CaSR的水平被抑制（P<0.05）,CaMK蛋白的mRNA水平并未改变。A23187、TG和BHQ可增加[Ca2+]i水平,亦增强了DIM抗肝癌效应（P<0.05）。BAPTA/AM、2-APB和U73122降低[Ca2+]i水平,缓解了DIM诱导的凋亡效应（P<0.05）。BAPTA/AM能够明显减轻DIM的抗肝癌效应,且与p-p38 MAPK活化和细胞凋亡减少有关,但对DIM的增殖抑制却未见改变。使用EGTA降低细胞外[Ca2+]i水平,DIM抗肝癌作用都能够被缓解（P<0.05）。钙离子内流与钙离子从细胞内钙库中释放都与DIM引起细胞内游离钙水平的升高有关。4.与60μM DIM处理组相比,荧光探针显示米贝地尔预处理可升高[Ca2+]i,并增强DIM抗肝癌效应（P<0.05）。结论:DIM对肝癌细胞具有增殖抑制和凋亡诱导效应,呈现浓度-效应和时间-效应关系,且抗肝癌效应与[Ca2+]i升高及p38 MAPK的磷酸化激活有关,特别是Ca2+离子供体可增强DIM的抗肝癌作用,提示DIM与Ca2+离子供体的联合治疗可成为肝细胞癌治疗的新方法。
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