论文部分内容阅读
研究背景随着生活水平的提高及工作习惯的改变,急性心肌梗塞的发病率逐年上升。如何治疗急性心梗、降低其死亡率成为一个世界性的难题。由于该病的长期和短期发病率及致死率与心肌梗死的面积直接相关,所以如何及时恢复缺血心肌的血流灌注、减少心梗的面积,成为急性心梗的重要治疗方向之一。直接经皮冠状动脉介入术(PCI)作为一种快速恢复心肌血管灌注的方法,成功挽救无数急性心梗患者的生命。然而人们发现,在缺血心肌恢复血流的过程中,血流再灌注本身会对心肌造成进一步的损伤,增大心梗面积。此现象即为缺血再灌注损伤。再灌注损伤严重影响心梗患者的预后。因此,在恢复冠脉血流的同时减少再灌注损伤,成为治疗心肌梗死的首选方法。心肌缺血再灌注损伤发生机制复杂,主要包括活性氧学说、炎症学说、细胞凋亡学说、钙超载学说和能量障碍学说等,但前三种学说是目前比较公认的心肌缺血再灌注损伤的主要发生机制。心肌缺血再灌注损伤的治疗方法有很多,主要包括药物治疗、物理治疗和基因治疗。药物治疗是目前心肌缺血再灌注损伤临床应用和研究较多的治疗方法,包括化学药(如他汀类药物、肾素-血管紧张素系统类、糖皮质激素类等)、中药(如黄连素、冠心宁、苦碟子等)、多肽药物(如脑利钠肽)等。这些药物具有一定的保护心肌作用,但疗效不甚显著。物理治疗主要包括缺血预适应、缺血后处理、远处缺血处理等。但因其机制不明,疗效不确切,临床应用受到局限。基因治疗是一种新的治疗模式,为心肌缺血再灌注损伤的治疗开辟了新的前景,但目前真正意义上的心肌缺血再灌注损伤的基因治疗还未完全开展,其最终的应用价值仍值得深入探讨。所以尽管防治心肌缺血再灌注损伤的方法很多,但疗效并不理想,寻找一种安全可靠、疗效显著的心肌缺血再灌注损伤的治疗方法,仍是心血管疾病研究领域的难点和热点问题之一。气体治疗是近年来新兴的一种治疗缺血再灌注损伤的新方法,其主要原理为减少活性氧的产生或抑制炎症反应。用于气体治疗的气体主要有NO、CO、 H2S等。但这些气体对人体具有一定的毒性,其应用受到限制。氢气作为一种无毒的还原性气体,其在缺血再灌注损伤中的抗氧化作用逐渐被人们发现。口前治疗缺血再灌注损伤的主要供氢气方式为直接吸入法和饮用或注射氢气盐水法,但由于氢气的易燃易爆和极易扩散的特性,这些供氢气方法一面存在安全隐患,一方面制作、运输、保存较困难,成本较高,另一方面到达心肌的氢气有效剂量较低,往往难以达到疗效。脂质微泡是一种由脂质外壳包裹惰性气体而成的一种声学造影剂,已广泛的应用于临床。其脂质外壳较致密,能够包裹氢气并抑制其扩散。同时,脂质微泡粒径多在微米级,不能自由穿过血管壁,能够防止氢气在到达心肌组织前扩散至其他组织间隙。由此,我们提出：拟用脂质包裹氢气以制作一种载氢气的脂质微泡,用于心肌缺血再灌注损伤的治疗,以探索一种简单安全的氢气治疗的新方法。目的1.探索脂质微泡搭载氢气以制作氢气微泡的可行性；2.探索氢气微泡治疗心肌缺血再灌注损伤的可能性及其机制。材料和方法1.实验材料实验仪器与试剂：制作脂质微泡的磷脂材料DSPC、DSPE-PEG2000购自美国Avanti公司,安全无菌,组织相容性好。全氟丙烷气体购自天津核工业理化工程研究院；氢气购自深圳市深特工业气体有限公司,纯度达99%以上；氢气微电极系统购自丹麦Unisense公司,此系统由化学系统、信号处理系统和微操作系统三部分组成。化学系统即是氢气微电极,信号处理系统包括信号交换器和皮安表。其工作原理为氢气经扩散作用经过氢气微电极的硅膜后,在传感器的铂阳极处氧化产生电子流。在传感器电子流从氧化的阳极流向内部的参比,同时皮安表获得线性的氢气分压信号。此系统在水中检测氢气的极限浓度为0.3μM; VEVO2100小动物超声成像仪购自VisualSonics公司,应用与其配套的MS-250超声探头(中心频率21MHz,宽带频率13MHz～24 MHz,分辨率达到75微米,实时帧频大于500fps),在M-MODE模式下测量大鼠的左室射血分数和短轴缩短分数。实验动物：SD雄性大鼠购自广东省实验动物中心,体重250～300克,饲养于SPF级环境中。2.实验方法2.1氢气微泡的制备与表征DSPC,DSPE-PEG2000以摩尔比9：1,利用薄膜震荡法制作氟氢比(C3F8/H2)为3：0、1：1和0：3的脂质微泡。测量比较不同微泡的粒径、浓度和含氢量,并在显微镜下观察微泡的形态。挑选出含氢量高、粒径和浓度均适宜的微泡做后续实验。利用氢气微电极系统检测氢气微泡在体外PBS溶液中和大鼠左心室腔内随时间的释氢曲线。将浓度为5×105、5×106、5×107、5×108、5×109/ml的氢气微泡装入橡胶袋中,应用VEVO2100超声成像仪对其进行超声成像,并测量每种微泡的视屏强度信号。将2×1010个氢气微泡经尾静脉注入大鼠体内,应用VEVO 2100超声成像仪检测左心室造影成像的效果,并绘制时间-视频强度曲线。2.2动物模型的制备及分组取成年雄性SD大鼠麻醉后切断左侧第3或第4根肋骨,暴露心脏结扎左冠状动脉形成心肌缺血,30分钟后松开结扎线形成再灌注。所有大鼠随机分为三组：①假手术组,只进行开胸手术,不进行缺血操作；②普通微泡组,再灌注前5分钟经尾静脉注入一定量未载氢气的普通微泡；⑧氢气微泡组,再灌注前分钟经尾静脉注入一定量氯气微泡。为研究心肌梗死面积与氢气微泡剂量的关系,在②、③组中另设高剂量组和低剂量组。高剂量,每只大鼠注入2×1010个微泡；低剂量,每只大鼠注入4×109个微泡。2.3缺血区及梗死区面积的测量再灌注24小时后开胸拉紧结扎线形成与之前相同的心肌缺血,经尾静脉注入伊文思蓝染液以区分缺血区与非缺血区。迅速处死大鼠后取心脏沿短轴位做切片,进行TTC染色,以区分梗死区与非梗死区。测量梗死区的面积(INF)、缺血区面积(AAR)和左心室的面积(LV),并计算AAR/LV、INF/AAR及INF/LV。2.4超声心动图测定大鼠心肌功能再灌注24小时后,用VEVO 2100小动物超声成像仪测量各组大鼠的左室射血分数和短轴缩短分数,以评价各组大鼠的心功能。2.5 H&E染色观察各组大鼠的心肌结构变化再灌注24小时后,取大鼠心脏做石蜡切片,进行H&E染色,显微镜下观察各组大鼠的心肌结构。2.6 TUNEL检测心肌细胞凋亡再灌注24小时后,取大鼠心脏做石蜡切片,利用TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞的凋亡。2.7炎性因子TNF-α,IL-1β的检测再灌注24小时后,取大鼠心脏作组织匀浆,ELISA法检测各组大鼠心肌组织中炎性因子TNF-α, IL-1β的含量。2.8活性氧H2O2、NO·、·OH及O2-·的检测再灌注40分钟后,取大鼠心脏作组织匀浆,迅速与CM-H2DCFDA、DAF-2DA、HPF及MitoSOX指示剂反应,酶标仪测定各自的荧光强度以计算各自的浓度。2.9毒性实验取健康SD大鼠3只,注射氢气微泡前经尾静脉抽取大鼠血液100μl,注射氢气微泡后第3、7天再分别取血液100μl。用全自动血细胞分析仪对大鼠血液样品进行分析。第7天取完血液后,离颈处死并取大鼠的心、肝、脾、肺、肾做石蜡切片,行H&E染色,观察其结构改变。并用3只未注射氢气微泡的健康大鼠作对照。2.10统计方法所有结果以均值±标准差表示,心肌梗死面积、左心室功能的比较采用两独立样本t检验,心肌细胞凋亡、炎症因子、活性氧的比较采用One-way ANOVA分析,组间多重比较用Bonferroni法。所有统计分析均采用SPSS13.0软件,并以P<0.05作为显著性检验标准。结果1.成功制得不同C3F8/H2的氢气微泡,其中C3F8/H2为1：1的氢气微泡的含氢量最高,达(1.46±0.08)μmol/ml,微泡的平均粒径为(0.89±0.03)μm,浓度为(2.29±0.07)×1010/ml。光镜下微泡呈中心透亮的球形,大小较均匀。2.氢气微泡在体外PBS溶液及体内左心室腔内均能自发释放氢气。3.氢气微泡在体外、体内均能实现超声增强造影成像。4.与普通微泡组相比,氢气微泡组大鼠心肌梗死面积显著减小(P<0.05)。高剂量的氢气微泡与低剂量相比,其心肌梗死面积更小(P<0.01),对心肌的保护作用更显著。5.与普通微泡组相比,氢气微泡组的心肌细胞凋亡数显著减小,显微镜下氢气微泡组大鼠的心肌结构明显好于普通微泡组。同时,氢气微泡组EF、FS均明显高于普通微泡组(P<0.05),说明氢气微泡能保护缺血再灌注损伤后的心肌功能。6.与普通微泡组相比,氢气微泡组大鼠心肌组织中炎性因子TNF-α、IL-1β的含量明显减低,说明氢气微泡能显著缓解心肌的炎症反应。7.与普通微泡组相比,氢气微泡组大鼠心肌组织中·OH含量显著降低,而H2O2、NO·及O2-·含量未见明显差异。8.注射氢气微泡前及注射后3、7天大鼠的血常规检查各项指标均在正常值范围内。大鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要内脏器官组织结构未见明显异常改变。结论1.脂质微泡可以包裹氢气,是一种理想的氢气载体。2.氢气微泡可显著减少心肌缺血再灌注后心肌的梗死面积,抑制心肌细胞凋亡,保护心肌结构,并且改善心肌收缩功能；3.氢气微泡可以抑制缺血再灌注后心肌的炎性反应,抑制·OH的生成,减少心肌损伤；4.氢气微泡的生物相容性好,对大鼠无毒性。上述结果表明氢气微泡在心肌缺血再灌注损伤中可以起到保护心肌的作用,这为临床治疗缺血再灌注损伤提供了一种新方法。同时也为超声成像引导下的可视化气体治疗提供了新的思路。