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目的:研究镉是否通过抗苗勒管激素(AMH)负调控干细胞因子(SCF)从而参与镉暴露所致的卵巢细胞损伤并初步探讨可能参与调控镉暴露所致AMH表达变化的mi RNA,为进一步阐明镉致卵巢毒作用及机制提供科学依据。方法:1.取21日龄55-65g雌性SD大鼠卵巢颗粒细胞体外培养24h后,分别用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L Cd Cl2染毒,同时设置阴性对照组(不含Cd Cl2的培养基)。12 h后提取总RNA和总蛋白,分别运用荧光定量PCR和Western Blot检测AMH和SCF的mRNA和蛋白表达水平变化。2.运用人卵巢颗粒瘤细胞系(COV434)作为工具细胞,以质粒为载体运送AMH sh RNA进入细胞内稳定敲低AMH基因,然后实验设置为20μmol/L的氯化镉处理人卵巢颗粒瘤细胞系(COV434)组;20μmol/L的氯化镉处理载体对照组(COV434-AMH-C);20μmol/L的氯化镉处理转染的目的基因敲低组(COV434-AMH-sh RNA),12 h后,提取总RNA和总蛋白,分别运用荧光定量PCR和Western Blot检测SCF的mRNA和蛋白表达变化。3.首先,运用mi Rbase、Target Scan等数据库结合文献以及我们的mircro RNA芯片筛选可能调控AMH表达的mi RNA,然后取21日龄55-65g雌性SD大鼠卵巢颗粒细胞体外培养24 h后,5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L Cd Cl2染毒,同时设置阴性对照组(不含Cd Cl2的培养基)。12 h后提取总RNA分别运用荧光定量PCR验证可能与AMH表达调控相关的mi RNA的变化。结果:1.镉暴露大鼠卵巢颗粒细胞中AMH与SCF表达水平变化:在镉暴露21日龄SD大鼠卵巢颗粒细胞中,各染毒组与对照组相比,SCF mRNA表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05),趋势性检验提示在该剂量区间镉暴露与SCF mRNA表达水平之间呈剂量效应关系(P<0.05);各染毒组与对照组相比,SCF蛋白表达水平下调,差异有统计学意义(P<0.05),趋势性检验提示在该剂量范围内镉暴露水平与SCF蛋白表达水平之间呈剂量效应关系(P<0.05)。与此同时,各染毒组与对照组相比,AMH mRNA表达水平上升,差异有统计学意义(P<0.05),趋势性检验提示该剂量范围内镉暴露水平与AMH mRNA表达水平之间呈剂量效应关系(P<0.05)。各染毒组与对照组相比,AMH蛋白表达水平上升,其中20μmol/L Cd Cl2染毒组与对照组比AMH蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。趋势性检验提示该剂量区间的镉暴露水平与AMH蛋白表达水平之间呈剂量效应关系(P<0.05)。2.镉暴露AMH基因敲低的人卵巢颗粒细胞中SCF表达水平变化:(1)采用GFP标记的阴性对照优化细胞转染效率,获得24小时后转染效率。提示经嘌呤霉素筛选,存活下来的人卵巢颗粒瘤细胞系(COV434细胞)都转染成功,转染效率为100%。COV434细胞分别转染AMH-sh RNA和sh RNAc,然后检测AMH表达变化。结果AMH基因敲低组(COV434-AMH-sh RNA)与载体对照组(COV434-AMH-C)相比,AMH mRNA和AMH蛋白表达水平明显下降,AMH mRNA与AMH蛋白降低水平大于70%。(2)20μmol/L Cd Cl2染毒AMH基因敲低组(COV434-AMH-sh RNA)与20μmol/L Cd Cl2染毒的人卵巢颗粒瘤细胞系(COV434细胞)对照组相比,在AMH mRNA表达水平降低的同时SCF mRNA表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。20μmol/L Cd Cl2染毒的载体对照组(COV434-AMH-C)与20μmol/L Cd Cl2染毒的COV434细胞对照组相比,AMH mRNA表达水平无明显改变,但SCF mRNA表达水平略升高,差异有统计学意义(P<0.05)。20μmol/L Cd Cl2染毒的AMH基因敲低组(COV434-AMH-sh RNA)组与20μmol/L Cd Cl2染毒的载体对照组(COV434-AMH-C)相比,AMH mRNA表达水平降低的同时SCF mRNA表达明显水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)20μmol/L Cd Cl2染毒AMH基因敲低组(COV434-AMH-sh RNA)与20μmol/L Cd Cl2染毒的COV434细胞对照组相比,AMH蛋白表达水平降低的同时SCF蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。20μmol/L Cd Cl2染毒的载体对照组(COV434-AMH-C)与20μmol/L Cd Cl2染毒的cov434细胞对照组相比,AMH蛋白表达水平差异无统计学意义,SCF蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。20μmol/L CdCl2染毒的AMH基因敲低组(COV434-AMH-sh RNA)组与20μmol/L Cd Cl2染毒的载体对照组(cov434-AMH-C)相比,AMH蛋白表达水平降低的同时SCF蛋白表达明显水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。3.镉暴露卵巢颗粒细胞中AMH表达调控相关的mi RNA表达水平变化:在镉暴露的SD大鼠卵巢颗粒细胞中,各染毒组与对照组相比,mi R-129-5p、mi R-486、mi R-503-3p、mi R-871-3p表达水平降低,mi R-133a-5p、mi R-138-5p、mi R-325-3p、mi R-615表达水平上升。在高剂量组mir-450a-3p表达水平降低。结论:1.镉能通过上调抗苗勒氏激素(AMH)负调控干细胞因子(SCF)的表达参与大鼠卵巢细胞损伤。2.在镉暴露的未成年SD大鼠卵巢颗粒细胞中,mi R-129-5p、mi R-486、mi R-503-3p、mi R-871-3p、mir-450a-3p可能参与调控镉暴露所致的AMH表达水平的改变。