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在植物与病原菌的互作过程中,植物细胞程序性死亡(apoptosis)发挥着重要的作用。植物受病原菌侵染后,在侵染部位产生过敏性反应,局部细胞死亡限制病原菌对植物的进一步伤害,表现出对病原菌的抗性。抗性反应是由植物体内的抗性基因(R)发挥作用,通过抗性信号传导改变植物体内一些基因的表达,活性氧中间物和水杨酸的积累,使植物表现出局部的细胞死亡。细胞程序性死亡相关基因,在植物抗病过程中发挥重要作用。拟南芥LSD1基因编码一个具有锌指结构的蛋白,负调控植物细胞程序性死亡,lsd1突变体表现自发的细胞死亡,同时对致病性病原菌的抗性提高。LOL1是LSD1的同源基因,其功能与LSD1相反,是细胞程序性死亡的正调控因子,过量表达后植株对病原菌的抗性提高。因此,认为具有此类锌指结构的蛋白与细胞程序性死亡和抗病有关。
为了研究水稻中该类锌指蛋白在水稻中是否也参与细胞程序性死亡的调控和抗病性,通过水稻全基因组搜索,发现7个基因编码蛋白具有锌指结构,其中之一命名为OsLOL2,OsLOL2以前曾被命名为OsLSD5,由于考虑到它与LOL2的同源性更高,且都具有2个锌指结构,因此又改名为OsLOL2。通过PCR的方法从水稻cDNA文库中扩增得到OsLOL2,测序并进行序列分析表明,OsLOL2的开放读码框有492个核甘酸,编码蛋白含有163个氨基酸,具有2个类LSD1的锌指结构。锌指结构与LSD1和LOL1锌指结构的同源性很高,与LSD1锌指结构同源性为74.5%,与LOL1为75%。OsLOL2与LSD1和LOL1的同源性较低,分别为24%和29%,与LOL2的同源性相对较高,达到42%。这说明该类锌指蛋白除了锌指结构的高度保守以外,其它区域同源性较低。通过对3个水稻品种(日本晴,MH63和IR24)Southern blot杂交分析表明,OsLOL2在水稻基因组中为单拷贝,水稻全基因组序列搜索分析发现也只有一个基因存在。
利用PCR扩增所获得的OsLOL2基因,构建了sense和antisense植物表达载体。通过农杆菌介导的与愈伤组织共培养的方法转化水稻后。分别获得了111个正义(sense)表达转化系和99个反义(antisense)表达转化系。对转化系的表型特征从T1到T3代进行观察和分析表明,与对照相比,正义表达的转化系无明显的表型上的改变,反义表达的转化系表现出矮化的表型特点,相当于野生型株高的70%。分别选取了3个正义表达的和反义表达的转化系进行半定量RT-PCR分析检测OsLOL2的内源转录水平,结果表明在正义表达的转化系中OsLOL2表现为过量表达,反义表达的转化系OsLOL2的表达量降低。用外源赤霉素(GA3)处理反义表达的转化系后,转化株节间开始伸长,株高得到恢复,说明矮化可能是由于内源活性赤霉素的缺乏引起的。用ELISA的方法对转化系内源赤霉素GA1的含量进行检测,结果表明在正义表达的转化系中内源GA1的含量比野生型植株略有增加,平均提高了约18%,而在反义表达的转化系中内源GA1的含量比野生型植株低了约50%,同时对水稻中参与赤霉素合成的3个重要的基因(OsKS1,OsKO2和OsGA3ox2)的表达水平进行了分析,结果表明在反义表达的转化系中OsKS1的表达量降低,OsKO2和OsGA3ox2无明显的改变,说明在反义表达的转化系中OsKS1基因的表达受到影响。在正义表达的转化系中OsKS1的表达与野生型无明显的差别。
为了研究OsLOL2与水稻抗病的关系,对3个正义表达的和反义表达的转化系接种了来自菲律宾和中国的14个致病力不同的白叶枯病生理小种(race0(PXO40),race1(PXO41),race2(PXO86),race3(PXO1845),race5(PXO112),race6(PXO99),race9(PXO2484),C1(HLJ72),C2(HB17),C3(NX42),C4(Z173),C5(GD1358),C6(LN57),C7(JS49-6)),接种后14天的病斑长度结果分析表明与野生型相比正义表达的转化系的病斑长度缩短,说明对白叶枯病的抗性提高,反义表达的转化系的病斑长度增长,对白叶枯病的抗性降低。这说明OsLOL2在水稻中参与了对白叶枯病的基本抗性反应。正义表达的和反义表达的转化系接种致病性稻瘟菌(Y34)7天后,野生型植株叶片病斑出现并逐渐扩大,表现明显的感病症状,而正义表达的和反义表达的转化系只出现过敏性反应,无明显病斑出现和扩大的症状,说明正义表达的和反义表达的转化系均表现出对稻瘟菌的高度抗性。正义表达的和反义表达的转化系对稻瘟菌的反应令人迷惑,我们对正义表达的和反义表达的转化系的3个致病性相关基因(PR1,POX22.3和POX8.1)的表达进行了检测,结果PR1和POX22.3在正义表达的和反义表达的转化系中均表现出组成性表达的特点,而POX8.1在野生型和转化系中均未检测出表达,说明在对稻瘟菌的抗性反应可能有PR1和POX22.3的参与。
为了研究OsLOL2基因的异源表达以及在烟草中OsLOL2基因是否也会参与抗病,用OsLOL2基因正义表达的载体转化烟草(SR1),获得20个转化系,并进行了潮霉素抗性基因的PCR检测。通过对转化系的T0和T1代的观察分析,发现与野生型相比转化株生长缓慢,植株表现矮小,种子在培养基上发芽晚。接种烟草青枯病后,转化株表现对青枯病抗性提高。
利用OsLOL2-GFP融合蛋白表达载体转化烟草悬浮细胞系BY-2和水稻,荧光显微观察BY-2悬浮转化细胞和转化的水稻根尖细胞,结果显示绿色荧光主要集中于核内,说明OsLOL2蛋白定位于细胞核内。OsLOL2是做为转录因子在细胞核内发挥作用的。
细胞程序性死亡敏感基因(Cellular Apoptosis Susceptivity)在细胞的有丝分裂、将importinα从细胞核内运出到核外和生长发育中具有重要的作用。酵母CSE1决定了准确的有丝分裂和酵母的活性。人类的CAS在毒素和肿瘤坏死因子诱导的细胞死亡过程中发挥重要作用。酵母Cselp可帮助把importinα从细胞核内运出到核外。
在水稻中发现一个与细胞程序性死亡敏感基因同源的基因,命名为OsCAS。根据该基因的序列从水稻cDNA文库中扩增到该基因的3端973bp的片段。OsCAS的开放读码框含有2952个核甘酸,编码一个983个氨基酸的蛋白,该蛋白序列与酵母CSE1同源性达到69%,与果蝇Dcas的同源性为63%,与人类CAS和小鼠Cse11的同源性为62%。拟南芥基因组中也有一个与CAS同源的基因,命名为AtCAS,推测的蛋白序列与OsCAS的同源性可达到88%。对2个水稻品种(日本晴和MH63)的Southern blot杂交分析和水稻的全基因组序列分析表明,OsCAS是单拷贝基因,且无同源基因存在。
根据PCR所扩增的的基因片段构建了antisense转化载体,并转化水稻。共获得105个转化系。对所获得的转化系进行表型特征观察分析,发现从T1到T3代,antisense转化系均表现出矮化的特点。选取3个具有明显矮化特征的转化系,对OsCAS基因的转录水平进行半定量的RT-FCR检测,发现在转化系中OsCAS基因的表达被抑制,说明转化系的矮化与OsCAS基因的表达有关。有关OsCAS基因的功能还需要进一步的研究分析。