论文部分内容阅读
蛋白酶类（如磷脂酶A2、类凝血酶、金属蛋白酶等）在蛇毒中广泛存在，它们具有丰富生物学功能。其中蛇毒PLA2能够水解甘油磷脂，其机制主要是使底物的sn-2位的酯键断裂，从而产生产物溶血磷脂和脂肪酸。它的生物学功能根据近年来的研究主要有水肿活性、抗凝血活性和肌肉毒性等，这使得其在药理学上具有广泛的应用。
中华眼睛蛇粗毒经过两步层析法得到NatratoxinⅡ蛋白。肽指纹谱分析表明，NatratoxinⅡ属于酸性PLA2。对NatratoxinⅡ的酶学特性进行表征，NatratoxinⅡ具有较高的酶学活性，比同类型的酸性PLA2的活性高，在35-40℃及pH7.5-8.0条件下具有最高酶活。同时，利用不同的二价金属离子替换反应体系里的Ca2+证明了Ca2+离子是PLA2发挥磷脂水解活性所必须的。
以往的研究表明，蛇毒中的某些蛋白成分可以通过作用于血管平滑肌细胞上的离子通道，进而影响血管的收缩和舒张。在本研究中，血管环张力实验表明，NatratoxinⅡ可以使收缩的血管进一步收缩。利用特异性阻断剂进行阻断实验发现TEA能完全阻断NatratoxinⅡ的血管收缩活性，说明NatratoxinⅡ作用于平滑肌细胞膜上大电导钙激活钾通道(BKCa)。
因为没有获得质量较好的晶体衍射数据，所以并没有得到NatratoxinⅡ的三维结构。但是NatratoxinⅡ与之前报道的Natratoxin两者在一级序列上只有六个氨基酸残基的差别。这六个氨基酸残基都位于蛋白质表面，对蛋白质的整体结构影响不大，因此我们直接采用用Natratoxin的晶体结构对NatratoxinⅡ的结构功能关系进行分析。通过Natratoxin和NatratoxinⅡ两者结构的对比分析，我们推测:虽然在NatratoxinⅡ中三个连续的Asn氨基酸的突变(T106N、D107N、A108N)在结构上产生的影响非常微小，但是少量电荷性质的改变却直接改变了NatratoxinⅡ结合通道的类型。
综上，在本文中，我们从中华眼睛蛇毒中分离得到了一个蛇毒PLA2家族的蛋白NatratoxinⅡ。对其功能进行研究发现，此蛋白能作用于平滑肌细胞上的BKCa通道。其收缩血管环的活性较本课题组分离的其它PLA2家族蛋白的收缩活性要高。对此蛋白的研究将为蛇毒PLA2的应用提供新的途径。
另外，我们还解析了重组蛋白Y2与α-Chymotrypsin复合物的晶体结构并详细分析了Y2与α-Chymotrypsin的结合界面。结果表明，Y2主要通过Arg16/Lys17/Try19与α-Chymotrypsin形成的氢键以及其它的疏水相互作用稳定在蛋白酶的底物结合口袋，阻止底物分子的进入从而抑制α-Chymotrypsin的酶活性。这种结合方式是Kunitz型毒素抑制蛋白酶底物水解活性的主要方式。除此之外，Y2晶体结构的首次解析也为我们分析Y2抑制Kv1.3的分子机制提供了结构基础。